[发明专利]一种从动物组织中提取AAV DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从动物组织中提取AAV DNA的方法，其步骤包括：配制所需的溶液1‑6，获取组织样本并匀浆；取适量样本加入容器管并添加适量的溶液1；先后加入适量的溶液2和溶液6，振荡孵育并使样本细胞裂解完成；冷却至室温，向其中添加溶液5，孵育后加入适量的溶液3，混合并降温；离心然后过滤；向上清液中加入1倍体积的乙醇；溶液加载到回收柱中，用溶液4洗涤回收柱若干次；用水对回收柱洗脱若干次，取适量洗脱溶液转移至新容器管中，涡旋并剪切洗脱溶液中的染色体DNA；添加适量的10X的核酸外切酶V缓冲液；添加适量的ATP溶液；添加适量的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，添加适量的溶液5，孵育过夜；使用DNA纯化试剂盒进行纯化等步骤。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种从动物组织中提取AAV DNA的方法。

背景技术

AAV是指腺相关病毒载体。现有技术中，从动物组织中提取AAV DNA的方法通常是使用基因组 DNA 提取试剂盒提取整个 DNA，或是使用质粒 DNA 提取试剂盒提取低分子量DNA 或遵循 Hirt 程序 (Hirt, 1967) 或它的一些修改版本 (Arad, 1998; Bardelli etal , 2017)。

在 AAV 衣壳的体内定向进化过程中，需要从动物组织中对衣壳序列进行 PCR 扩增，以生成能够感染特定组织靶标的丰富变体文库。最简单的样品制备方法是从非常小的组织样品（通常约为 10 mg）开始，然后使用 DNA 纯化试剂盒从中分离出总 DNA。一个明显的限制是样本可能不代表整个组织或器官，甚至可能不包括任何 AAV。另一个困难是，与宿主基因组 DNA 的数量相比，AAV DNA 的数量通常微不足道。由于 DNA 聚合酶被 DNA 抑制，因此样品需要高度稀释才能用作 PCR 模板，导致会进一步稀释可能存在的少量 AAVDNA。因此，当 PCR 产物完全可以产生时，可能无法包含最有希望的序列变体，而可能只包含少数碰巧被偶然扩增的序列。为解决上述的问题，现有技术中第一种方法是从组织的不同部位收集多个样本并并行处理它们。另一种方法是使用所谓的 Hirt (1) 程序或其衍生物 (2,3) 或简单的质粒分离试剂盒选择性分离低分子量 DNA 而不是总 DNA。这些都不是完全令人满意的方法，因为实际回收的 AAV DNA 数量有限，通常与大量污染的宿主 DNA混合，最终导致 PCR 期间的序列偏差。

发明内容

本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的AAV回收方法存在的问题，提供一种能够解决前述问题的从动物组织中提取AAV DNA的方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：从动物组织中提取AAV DNA的方法，其包括以下步骤：

S1、配制所需的溶液，溶液1包含有Tris-HCl和EDTA，pH值为 7.5；溶液2包含有SDS水溶液；溶液3包含有CsCl、K-乙酸和乙酸；溶液4包含有NaCl、Tris-HCl和乙醇，pH值为7.5；溶液5为RNase A 溶液；溶液6为蛋白酶 K 溶液；

S2、从所选动物的整个器官中获取组织样本，将组织样本转移到洁净的研钵中，将组织样本切碎成小块，然后用研杵匀浆直至糊状物变稠；

S3、从步骤S2处理后的样本中取适量转移到容器管中，向容器管内添加适量的溶液1；

S4、向步骤S3所述的容器管中加入适量的溶液2，然后加入适量的溶液6，在50-60℃下振荡孵育2-6小时，使样本细胞裂解完成；

S5、将S4裂解完成的样本细胞溶液冷却至室温，向其中添加适量的溶液5，混合均匀，并在室温下孵育30分钟以上；

S6、向步骤S5所述的溶液中加入适量的溶液3，立即轻轻混合并置于冰上降温30分钟以上；

S7、在4℃下以5000g离心15-30分钟，通过纱布对溶液进行过滤，将上清液转移到新的容器管中，再通过真空过滤器对上清液进行过滤；

S8、向步骤S7中用真空过滤器过滤后的上清液中加入1倍体积的乙醇，通过沉淀大部分DNA来防止目标AAV DNA的损失；