[发明专利]USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用。(1)本发明发现抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制塞内卡谷病毒的复制，即USP30可作为靶点用于筛选抑制塞内卡谷病毒复制的药物；(2)本发明提供了干扰塞内卡谷病毒复制的小干扰RNA，能够抑制塞内卡谷病毒的复制；(3)本发明提供了一种特异性靶向USP30基因的sgRNA，结合CRISPR‑Cas9技术实现了USP30基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系USP30‑KOs对SVA具有抗性表型，能够显著抑制SVA在细胞内的复制，为进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种USP30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用。

背景技术

塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属，属于单股正链RNA病毒，主要感染猪。SVA感染引发的水泡病与口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)和水泡性口炎(VS)引起的病变极为类似，具体表现为病畜鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等症状。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止该病的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。但由于SVA感染与致病机制仍不清楚，仍未有商品化的疫苗或药物问世。因此深入了解宿主蛋白抑制SVA复制的机制，通过CRISPR-Cas9技术构建抑制SVA病毒复制的细胞系对于塞内卡谷疫苗的生产意义重大。

RNA干扰技术的出现对选择毒性提出了可能，为抗病毒研究提供了新思路。RNA干扰是RNA序列特异性转录后基因沉默现象。与以往抗病毒治疗的手段相比，RNA干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，因此可将不良反应降到最小；RNA干扰能高效抑制病毒复制，少量的siRNA就可达到降低病毒表达产物的作用；RNA干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用，从而在一定程度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此，设计合成靶向塞内卡谷病毒基因组的siRNAs将可能成为抑制塞内卡谷病毒感染的有效途径。

USP30(ubiquitin specific peptidase 30)是位于线粒体外膜上的跨膜去泛素化酶(deubiquiti nating enzymes，DUBs)，可以抑制由泛素连接酶PARK2和蛋白激酶PINK1介导的线粒体自噬，调节线粒体的动态变化。之前的研究表明，USP30主要逆转线粒体上Parkin底物的泛素化。在神经元中，过表达USP30大大减弱了由CCCP诱导线粒体去极化而引起的线粒体自噬对线粒体的清除作用；而降低USP30的活性则增强了线粒体的降解。敲低USP30能缓解Parkin病理活性突变所引起的线粒体自噬障碍，以及在Parkin或者PINK1缺陷的果蝇中增强其线粒体的完整性。

本发明发现，通过抑制或沉默宿主USP30基因，能够抑制SVA的复制，可作为靶点用于制备抑制塞内卡谷病毒复制的药物。基于此，本发明以USP30基因为靶点，设计了小干扰RNA，所述小干扰RNA能够干扰SVA的复制，可用于制备抑制SVA复制的药物。而且为了进一步研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制，本发明设计了一种特异性靶向USP30基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向USP30基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了USP30基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系USP30-KOs对SVA具有抗性表型，能够显著抑制SVA在细胞内的复制，为研究USP30基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗SVA的动物育种。

发明内容