[发明专利]冠状病毒RNA双基因同时检测及突变毒株识别的检测试剂盒

说明书

本发明提供一种冠状病毒RNA双基因同时检测及突变毒株识别的检测试剂盒，由环介导扩增反应液、酶、引物和检测探针混合液、目标序列RNA标准品组成。本发明中目标RNA经逆转录生成对应DNA链，在扩增引物存在下进行LAMP扩增，扩增产物与检测探针‑分子信标(MB)或链置换核酸(OSD)结合产生荧光信号，从而实现目标RNA检测。本发明通过用不同荧光基团标记MB探针，可在同一体系内同时检测两个目标基因，用于同时检测新冠病毒ORF1ab基因和N基因；通过不同荧光基团标记OSD探针，用于单位点碱基差异的刺突蛋白(S)基因序列的分辨，实现新冠病毒野生型毒株、Alpha变异株、Delta变异株的识别。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及冠状病毒RNA的检测以及突变识别新技术，尤其涉及冠状病毒RNA双基因同时检测及突变毒株识别的RNA检测试剂盒，是基于逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的冠状病毒RNA双基因同时检测以及不同毒株识别的RNA检测试剂盒。能够为临床新冠病毒感染患者的早期诊断以及不同毒株的识别提供判断依据。

背景技术

冠状病毒是具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。到目前为止，大约有15种不同冠状病毒株被发现，能够感染多种哺乳动物和鸟类，有些可使人发病。人冠状病毒可对人造成普通感冒、严重急性呼吸综合征和中东呼吸综合征，在流行病学特征上存在一定的差异。

新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，它具有高传染性和高隐蔽性。SARS-CoV-2病毒严重威胁人民群众的人身安全，妨碍正常的经济活动。鉴于SARS-CoV-2潜伏期长，且在潜伏期也具有传染性，大规模的核酸检测成为刚需，急需检测速度快、灵敏度高、特异性强的检测试剂盒。

目前投入使用的SARS-CoV-2病毒检测试剂盒主要包括RT-qPCR法、胶体金免疫法和酶联免疫法等，这些方法有各自的优点，也存在一定的局限性。如胶体金法(检测试纸)用于病毒抗体检测，操作简单快速，能够实现快速筛查，但其因为灵敏度较低，带来了假阴性率较高的问题，而酶联免疫法受到仪器和灵敏度的制约。RT-qPCR法作为现阶段病毒核酸检测的“金标准”，其对检测环境和设备都有较高要求，需要复杂热循环接到变性、退火和随后的扩增延伸，需要昂贵的热循环装置，在资源有限或即时检验平台，其应用会受到一定的限制。

基于等温核酸扩增的病毒核酸检测方法近年来受到越来越多的关注，该方法克服了一些传统方法的局限性，如其所需反应温度是恒定的，不需要PCR反应的变温循环，因此对实验操作技能和仪器设备的要求较低，为核酸检测研究开辟了新的空间，同时又提高了核酸扩增的产量。其中LAMP是较为常用的等温核酸扩增技术，具有很高的灵敏度，该技术利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下进行靶标的识别和延伸，可在15-60分钟内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有高特异、高灵敏、简单、便捷及低成本的特点，已广泛用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查等。

发明内容

本发明的目的在于提供冠状病毒RNA双基因同时检测及突变毒株识别的RNA检测试剂盒，是一种基于RT-LAMP的冠状病毒RNA双基因同时检测及突变毒株识别的RNA检测试剂盒，试剂盒包括：环介导扩增反应液(硫酸镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸、甜菜碱、Thermopolbuffer和AMV RT buffer混合液等)、酶(Bst 2.0DNA聚合酶和AMV逆转录酶)、引物(ORF1ab基因和N基因引物、S基因扩增引物)、信号探针(ORF1ab基因和N基因为MB探针、不同毒株识别为OSD探针)和标准品(ORF1ab基因、N基因和不同毒株S基因RNA样品)，探针溶液需存放于棕色管。其中引物和信号探针的序列如下：

ORF1ab基因和N基因同时检测所需引物：

F3-ORF1ab

CAGCATTTCTTCACAAAGCT

B3-ORF1ab