[发明专利]一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法和应用

说明书

本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法和应用，属于工业微生物发酵工程的技术领域。本发明提供的耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌，拉丁文为Actinobacillus succinogenes GXAS‑137HFM，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年8月10日，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211004。本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS‑137HFM，该菌株对五羟甲基糠醛的耐受浓度为2.0～2.4g/L，相比于原始菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS‑137大大提高了对五羟甲基糠醛的耐受性。

技术领域

本发明涉及工业微生物发酵工程的技术领域，尤其涉及一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法和应用。

背景技术

丁二酸(Succinic acid)，又称琥珀酸(butanedioic acid)，是一种重要的C4平台化合物，广泛应用于化工、食品、医药等领域。作为一种重要的有机化工原料及中间体，可以转化为富马酸、1，4-丁二醇(BOD)、四氢呋喃(THF)等，同时也是合成聚丁二醇丁二酸酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)及PBS与己二酸共聚的PBSA等可生物降解高分子材料的原料，具有广阔的应用前景。

目前生产丁二酸的方法主要有三种：化学法、生物转化法、发酵法。商品化的丁二酸主要以石油等资源为原料由化学法合成，但存在生产工艺复杂、污染严重等一系列问题，严重抑制了其发展的潜力。随着石油资源日益枯竭以及环境污染日益严重等问题出现，化学法合成受到限制。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料价格低廉、为可再生的生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量CO₂，绿色环保；(3)发酵条件温和。因此，微生物发酵法近年来备受瞩目，成为近年来国内外的研究热点。

在自然界中有多种厌氧菌和兼性厌氧菌可利用各种糖类物质发酵合成丁二酸，琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)具有将戊糖和己糖转化为丁二酸的天然能力，使其成为目前最具工业化潜力的丁二酸生产菌株之一。

目前已经投产或正在建设的生物基丁二酸工业化项目基本以玉米或大麦等粮食作为主要原料，过度依赖粮食会影响国家的粮食安全，丁二酸属于大宗化学品，在丁二酸发酵生产制备的过程中，原料成本占有极其重的比例，所以使用价格低廉的非粮原料进行丁二酸发酵是降低丁二酸生产成本及实现产业化的关键。非粮生物质资源包括非食用的淀粉类和糖类作物、不可食用的糖蜜和乳清、农林畜牧业废弃物以及生活和工业生产产生的有机废弃物。木质纤维素为世界最大的可再生资源，可以将其中的纤维素(由葡萄糖构成)和半纤维素(主要由木糖构成)转化为单糖，用作微生物发酵生产丁二酸的碳源。

虽然已有较多关于琥珀酸放线杆菌利用木质纤维素的报道，但主要集中在原料的预处理，脱毒和发酵工艺优化方面。由于木质纤维素结构的复杂性，必须经过一系列预处理以后才能够被微生物高效利用，预处理过程中会产生一定量的发酵抑制物(呋喃醛类、弱酸类、酚类等)。呋喃醛类抑制物主要指糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)，与其他抑制物相比，呋喃醛类抑制物含量较高、毒性较强，且能够与其他抑制物形成协同抑制作用，是近年来抑制物研究的热点。二者会影响细胞糖酵解及生物合成途径关键酶的活性，破坏细胞膜组分及通透性，严重影响微生物的生长和降低发酵过程中葡萄糖和木糖的转化率。

在实际应用中，虽然生物质水解液脱毒等措施能减缓五羟甲基糠醛对发酵微生物的抑制作用，但这些方法只能去除或降低其中部分的抑制剂，且操作繁琐，成本高，不利于其大规模工业化应用。另外，有些脱毒过程还会污染环境。因此，增加发酵微生物的抗逆性和在胁迫环境下的生产效率极为必要，对木质纤维高效转化丁二酸具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌，用于在含有高浓度五羟甲基糠醛的培养基中生产丁二酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：