[发明专利]一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法

权利要求书

1.一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其特征在于，所述稳定T7表达系统包含T7RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。

2.根据权利要求1所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶带有核定位序列，任选地带有或不带有内含肽。

3.根据权利要求2所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因用于构建整合型载体，并转化真核菌株或真核细胞，构建基因组上携带有T7RNA聚合酶基因的宿主细胞或宿主菌株。

4.根据权利要求1所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶用于构建具有核定位序列的病毒加帽酶基因的载体，并且将包含目标基因片段的所述T7转录单元插入所述载体，得到含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体，所述病毒加帽酶任选地带有或不带有内含肽。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶为融合型或游离型。

6.根据权利要求1所述的稳定T7表达系统，其特征在于，将权利要求4中的含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体转化到权利要求3中的所述真核菌株或真核细胞中，由此构建所述稳定T7表达系统。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，选取真核生物的启动子作为表达所述T7 RNA聚合酶和所述病毒加帽酶的启动子，使用真核生物的终止子作为表达所述T7RNA聚合酶和所述病毒加帽酶转录的终止子。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述病毒加帽酶选自由呼吸道合胞病毒加帽酶、非洲猪瘟病毒加帽酶、口炎疱疹病毒加帽酶和乳酸克鲁维酵母线性质粒加帽酶组成的组中的至少一种。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的稳定T7表达系统，其特征在于，所述核定位序列选自由SV40 T-Antigen核定位序列、Nucleoplasmin核定位序列、EGL-13核定位序列、c-Myc核定位序列和TUS-protein核定位序列组成的组中的至少一种。

10.一种基于病毒加帽酶的稳定T7表达系统在真核生物中表达蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含T7 RNA聚合酶、T7转录单元和病毒加帽酶的稳定T7表达系统，其中，所述T7转录单元由T7启动子、T7终止子和目标基因构成。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)合成带有核定位序列的T7 RNA聚合酶基因序列，并将其构建到整合型载体中，所述T7 RNA聚合酶任选地带有或不带有内含肽，以构建融合型或游离型的T7 RNA聚合酶和病毒加帽酶；

2)将所述整合型载体直接转化或线性化后转化真核菌株或真核细胞株，得到基因组上整合了带有所述核定位序列的T7 RNA聚合酶基因的真核菌株或真核细胞株；

3)构建带有核定位序列的病毒加帽酶基因的载体，以含有目标基因的质粒为模板扩增包含有T7转录单元的目标蛋白DNA片段，回收所述在T7转录单元中包含目标基因的片段，将其插入带有所述核定位序列的病毒加帽酶基因的载体中，得到含有所述病毒加帽酶基因和目标基因的载体；

4)将3)中得到的所述载体转化到2)中的所述整合后的真核菌株或真核细胞株中，构建基于所述病毒加帽酶的稳定T7表达系统；和

5)使用所述稳定T7表达系统，用报告基因在所述重组的真核菌株或细胞株中表达目标蛋白。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，使用编码Nanoluc萤光素酶的基因或编码绿色荧光蛋白的基因作为报告基因验证所述表达系统表达的目标蛋白。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其特征在于，所述真核生物为酵母菌、丝状真菌、哺乳动物或昆虫。