[发明专利]几丁质酶突变体的制备及其应用

说明书

本发明借助重组蛋白技术实现BcchiA1在枯草芽孢杆菌中的分泌型表达，显著降低菌株本底蛋白的干扰，简化下游蛋白纯化工艺，控制生产成本。同时，本发明涉及公开几株高酶活几丁质酶突变体，酶比活力较BcchiA1野生型提高了18.47％‑28.36倍，其中，以BcchiA1(P55T/S216M/R301T)的酶比活性最优。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及环状芽孢杆菌几丁质酶突变体重组菌的构建及其相关应用。

背景技术

几丁质酶是一类用于断裂几丁质β-(1,4)糖苷键的水解酶，是几丁质降解过程中发挥关键作用的专一性酶，能够生成几丁寡糖、几丁二糖以及N-乙酰葡萄糖胺等。几丁质酶广泛分布于病毒、细菌、真菌、昆虫、高等植物和动物等多种生物体内，并在生命周期中执行诸多生物功能。此外，几丁质酶还可用于几丁质废物的生物处理、几丁寡糖的制备、生物防治剂以及用于菌株改良的真菌和酵母中分离原生质体等，在农业和环境等各个方面具有不可估量的应用潜力。

但是由于几丁质结晶度高，使几丁质酶与底物无法充分接触，导致生物酶法效率低下。因此，我们致力于找寻几丁质酶活性优异的菌株。其中，环状芽孢杆菌几丁质酶BcchiA1，对于不溶性的几丁质具有很高的亲和力和水解活性，应用价值巨大。

目前，许多微生物能够分泌一定量的几丁质酶，但是普遍存在分泌量不足的问题。重组蛋白技术是直接获取大量高纯度几丁质酶的重要技术手段。与其他外源基因表达系统相比，微生物表达系统因生长快、培养周期短、成本低廉等特点在蛋白表达技术中应用广泛，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母表达系统等。其中，枯草芽孢杆菌无致病性，不含外毒素和内毒素，是广泛应用于医药和食品加工业的安全菌种(GRAS)，尤其在生产和分泌酶等活性蛋白质方面潜力巨大，后续分离纯化步骤简洁、高效。此外，该宿主具有遗传背景清晰、分子操作简单、发酵周期短等特点，在应用微生物领域优势显著。

为了解决上述提及的关于野生型几丁质酶活性低的问题，本发明将在保证环状芽孢杆菌几丁质酶BcchiA1高效分泌表达的基础上，进一步提高酶活性，以期满足实际应用需求。

发明内容

本发明首先构建了一株高效分泌环状芽孢杆菌几丁质酶的枯草芽孢杆菌重组菌，并对BcChiA1关键残基进行一系列突变，旨在进一步提高几丁质酶的酶解效率。

本发明第一方面涉及公开一种几丁质酶单点突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的55位Pro突变为Thr，酶比活力比BcchiA1野生型提高了18.47％。

本发明第二方面涉及公开两种几丁质酶单点突变叠加的两点突变，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的55位Pro突变为Thr和81位Asp突变为Glu，或55位Pro突变为Thr和299位Tyr突变为Met，酶比活力比BcchiA1野生型分别提高了4.70倍、1.56倍。

本发明第三方面涉及公开七种几丁质酶单点突变叠加的三点突变，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的55位Pro突变为Thr、216位Ser突变为Met和301位Arg突变为Thr，或55位Pro突变为Thr、216位Ser突变为Met和299位Tyr突变为Met，或55位Pro突变为Thr、216位Ser突变为Met和326位Trp突变为Arg，或55位Pro突变为Thr、127位Trp突变为Leu和215位Ala突变为Val，或55位Pro突变为Thr、81位Asp突变为Glu和299位Tyr突变为Met，或10位Tyr突变为Met、55位Pro突变为Thr和299位Tyr突变为Met，或10位Tyr突变为Met、55位Pro突变为Thr和81位Asp突变为Glu，酶比活力较BcchiA1野生型分别提高了28.36倍、19.21倍、10.58倍、8.06倍、6.24倍、6.05倍、5.35倍。