[发明专利]一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法

权利要求书

1.一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法，其特征在于：

构建表达质粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A，转入大肠杆菌BL21(DE3)，经诱导、表达、体内自组装、初步纯化得到T7噬菌体病毒样颗粒；

其中，所述表达质粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A中含有T7噬菌体衣壳蛋白编码基因gp10A以及T7噬菌体支架蛋白编码基因gp9；

包括：

步骤一，合成T7噬菌体gp9和gp10A基因；

步骤二，构建T7噬菌体病毒样颗粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A表达质粒及菌株；

步骤三，T7噬菌体病毒样颗粒的诱导、表达、体内自组装；

步骤四，T7噬菌体病毒样颗粒的初步纯化；

步骤五，T7噬菌体病毒样颗粒的电镜观察；

步骤一中，所述T7噬菌体gp9基因的核酸序列为SEQ ID NO：1，所述gp10A基因的核酸序列为SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法，其特征在于，步骤二中，所述构建T7噬菌体病毒样颗粒pRSFDuet-1-gp9-gp10A表达质粒及菌株，包括：

(1)将合成的gp9基因序列插入pRSFDuet-1质粒MCS 1的BamH I和Sac I限制性内切酶位点中，获得含T7噬菌体gp9基因的表达质粒，命名为pRSFDuet-1-gp9；

(2)将合成的gp10A基因序列插入pRSFDuet1-gp9质粒MCS 2的Nde I和Xho I限制性内切酶位点中，获得T7噬菌体病毒样颗粒表达质粒，命名为pRSFDuet-1-gp9-gp10A；

(3)将pRSFDuet-1-gp9-gp10A转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得T7噬菌体病毒样颗粒表达菌株，命名为TT-103。

3.如权利要求1所述一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法，其特征在于，步骤三中，所述T7噬菌体病毒样颗粒表达菌株的诱导、表达、体内自组装，包括：

(1)TT-103菌株接种于含终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素的LB固体培养基，37℃，18～24h，获得单菌落；

(2)挑选TT-103单菌落，接种于10mL含终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素的LB液体培养液，180rpm/min，37℃，过夜培养；

(3)取5mL步骤(2)培养的菌液，加入到500mL含终浓度为0.1mg/mL的卡那霉素的LB液体培养液，180rpm/min，37℃，培养至OD600约0.5时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，100rpm/min，30℃，诱导4h；

(4)诱导结束后，4℃，18000g/min，离心20min，收集菌体，用等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，将菌体重悬于含1mM PMSF蛋白酶抑制剂的PBS中；

(5)将步骤(4)制得的菌体悬液进行高压均质破碎，设置压力为600bar，处理时间为12min，均质温度为4℃；随后，18000g/min，4℃，离心20min，收集沉淀和上清液；

(6)利用SDS-PAGE测定步骤(3)未诱导的菌液及步骤(5)获得的菌体高压均质沉淀和上清液中的目标蛋白。

4.如权利要求1所述一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法，其特征在于，步骤四中，所述T7噬菌体病毒样颗粒的初步纯化包括：

(1)35％(w/v)蔗糖垫层缓冲液超高速离心，蔗糖缓冲液与上清液体积比为1：2，100000g，4℃，离心1h，收集上清液，沉淀用缓冲液A重悬；其中，所述缓冲液A包含20mMTris-HCl，250mM KCl，pH＝4.0；

(2)利用SDS-PAGE测定步骤(1)收集的上清液和沉淀中的目标蛋白。

5.如权利要求1所述一种基于单质粒的T7噬菌体病毒样颗粒自组装方法，其特征在于，步骤五中，所述T7噬菌体病毒样颗粒的电镜观察，包括：取20ul样品，滴于铜网上，用3％磷钨酸负染并吸取多余染液，晾干后，使用透射电镜观察分析。