[发明专利]腈水合酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种腈水合酶突变体或其片段，其特征在于，与野生型腈水合酶相比，所述突变体或其片段包含以下至少一种突变：

突变I：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-1和α螺旋-2之间的结构域上的疏水性氨基酸突变；

突变II：距离活性中心残基-C(S/T)LCSC(T/Y)范围内的无规则卷曲结构域上的极性氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的腈水合酶突变体或其片段，其中所述野生型腈水合酶来源于玫瑰色红球菌、嗜吡啶红球菌、红色红球菌或诺卡氏菌。

3.根据权利要求1或2所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变I中，所述结构域包含片段1：-G(M/I)SW-；

优选地，所述突变为其中的甲硫氨酸、异亮氨酸或色氨酸突变；更优选地，所述甲硫氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸，或

所述异亮氨酸突变为半胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸；和/或

所述色氨酸突变为丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或组氨酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，突变II中，所述结构域包括选自以下的片段中的至少一个：

片段2：-(S/T)(S/T)(S/A)(E/D)(I/L/V/M/T)-；

片段3：-G(Y/F)(A/S/T)(G/S)(E/R)(Q/H)(A/G)(H/E)-；

片段4：-H(D/G)TGGMTGY-；

片段5：-K(N/S)MNPL(G/E)HTR-；

任选地，所述突变选自以下的一种或多种：

片段2中，一个或多个苏氨酸突变为丝氨酸；和/或

一个或多个丝氨酸突变为甘氨酸；和/或

天冬氨酸或谷氨酸突变为苏氨酸；

片段3中，酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸；和/或

谷氨酰胺突变为天冬酰胺；和/或

苏氨酸突变为丝氨酸；和/或

谷氨酸突变为天冬氨酸；

片段4中，天冬氨酸突变为半胱氨酸或缬氨酸；和/或

苏氨酸突变丙氨酸；和/或

酪氨酸突变为苏氨酸或丝氨酸；

片段5中，一个或多个天冬酰胺突变为丙氨酸；和/或

苏氨酸突变为丝氨酸；和/或

精氨酸突变为缬氨酸；和/或

赖氨酸突变为半胱氨酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的腈水合酶突变体或其片段，其中，与野生型腈水合酶相比，所述突变体或其片段进一步包含突变III和/或突变IV：

突变III：位于野生型腈水合酶β亚基的起始端的二级结构域α螺旋-7和β螺旋-1之间的结构域中的引入盐桥键；同时在位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构α螺旋-10和β螺旋-4之间的结构域引入二硫键；

优选地，突变III中，引入盐桥键的结构域包括片段6：-SFSLG-；更优选地，所述突变为将其中的丝氨酸突变为赖氨酸和/或亮氨酸突变为谷氨酸；

和/或，

所述突变III中，引入二硫键的结构域包括片段7：-GNGKD-，片段8：-VADP-；更优选地，所述突变为将其中的天冬氨酸和脯氨酸突变为半胱氨酸；

和/或

突变IV：位于野生型腈水合酶β亚基的二级结构α螺旋-2结构域中的极性氨基酸突变；优选地，其包括片段9：-RNKIG；更优选地，所述突变IV为将其中的天冬酰胺突变为丝氨酸。

6.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码如权利要求1至5中任一项所述的腈水合酶突变体或其片段的核苷酸序列。

7.一种表达载体，其包含如权利要求6所述的分离的核酸分子；

优选地，所述表达载体为质粒载体，优选pET系列、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；

更优选地，所述表达载体为pET-28a或pNV18.1。