[发明专利]人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。包括以下步骤：(1)将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304‑Pg3；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304‑Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304‑Pg3上，获得重组表达载体；(2)将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。本发明首次采用枯草芽孢杆菌体系构建了人重组精氨酸酶I生产菌，显著提高了人重组精氨酸酶I的表达量和活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。

背景技术

精氨酸酶(L-Arginase)，又称L-精氨酸尿素水解酶，催化L-精氨酸生成鸟氨酸和尿素。精氨酸酶广泛分布在不同生物体内，如哺乳动物、爬行动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌类等。在哺乳动物中，目前发现有两种不同基因编码序列的精氨酸酶，其中：精氨酸酶I(Arginase I)主要位于哺乳动物肝脏器官的细胞质中，司职于尿素循环最后一步反应；精氨酸酶II(Arginase II)是一种线粒体酶，大量存在于尿素循环以外的机体组织中，其主要作用是调控平衡细胞中精氨酸/鸟氨酸的浓度。

目前国内外市场中精氨酸酶多是来源于动物脏器，Bach等人从牛肝中提取并纯化了精氨酸酶。但是近年来，由于朊病毒等一些病原微生物的存在，造成了某些人畜共患病的隐患，使动物来源的药物酶在应用于人体时受到极大的限制。

考虑到以上诸多因素，用基因工程的方法表达人精氨酸酶基因是使其能应用于生物医药领域的首选之策。人精氨酸酶I在1990年实现了原核表达，但受限于当时表达体系的发展水平，研究者采用的启动子无论是表达水平还是非诱导条件下控制转录的能力都有待提高。南京理工大学在2006年尝试了在毕赤酵母工程菌中表达人精氨酸酶I，但表达的蛋白没有分泌到酵母细胞外，表达量也偏低。复旦大学李益鹏等在2015年将获得的人精氨酸酶I全长cDNA克隆至原核高表达载体，通过自动诱导系统进行人肝脏精氨酸酶I的表达，重组人精氨酸酶I的产量为每升菌液48.5mg，其纯度超过95％。

上述利用基因工程表达人精氨酸酶I的表达系统多集中于大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统，但还未见有基于枯草芽孢杆菌表达体系生产人重组精氨酸酶I的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种人重组精氨酸酶I生产菌及其构建方法。本发明首次采用枯草芽孢杆菌体系构建了人重组精氨酸酶I生产菌，显著提高了人重组精氨酸酶I的表达量和活性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种人重组精氨酸酶I生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体(pHT304-Pg3-arg1)；

(2)将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。

优选的，步骤(1)中，对arg1基因进行了优化改造处理，首先将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸，基于突变后的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列重新获得了编码核苷酸序列，并进行了密码子优化；然后在优化后的核苷酸序列中增加了一段信号肽序列，并插入了凝血酶酶切位点和10个His尾巴。最终优化改造处理后的arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，步骤(1)中，Pg3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。