[发明专利]一种石油烃降解菌丰度的测定方法

说明书

本发明提供了一种石油烃降解菌丰度的测定方法，该方法包括：S1、使用缓冲溶液对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；S2、用DNA染色工作液对所述待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色，获得染色后的待测菌悬液；S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。本发明通过借助DNA荧光染色技术，将流式细胞仪用于石油烃降解菌丰度的测定，有效提升了石油烃降解菌丰度测定的精确度，减小误差。

技术领域

本发明涉及石油污染环境监测技术领域，特别涉及一种石油烃降解菌丰度的测定方法。

背景技术

石油烃降解菌在生物修复石油污染水体和土壤中发挥着关键的作用。通过烃降解菌生长发育过程中的新陈代谢活动对有毒有害的烃类物质进行降解，达到降低污染物浓度及毒性的目的。利用石油烃降解菌修复污染场地具有投资和运行成本低、操作简便、无二次污染、对污染场地土壤扰动小、工程量小等优点。而对石油烃降解菌的丰度进行准确测定，是评估石油烃降解菌修复石油污染水体或土壤效果的重要指标。

但现有技术中，目前多采用平板菌落计数，显微镜直接计数，分光光度法或者最大可能计数方法来测定石油烃降解菌的丰度，这四种方法都需要人工统计，耗时长，估算精度低，误差大，费时费力。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种石油烃降解菌丰度的测定方法。针对土壤组成的复杂性，以解决现有技术中，对石油烃降解菌丰度确定存在精确度低，误差大的问题。

具体内容如下：

本发明提供了一种石油烃降解菌丰度的测定方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、对油污土壤进行预处理，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液；

S2、用DNA染色工作液对待测菌悬液中的活菌和死菌进行恒温避光染色；获得染色后的待测菌悬液；

S3、借助流式细胞仪对染色后的待测菌悬液中的石油烃降解菌进行计数，获得石油烃降解菌的丰度值。

可选地，在所述步骤1中，所述预处理包括：

S11、将0.1g～1g油污土壤与1mL～10mL缓冲溶液的混合物进行3h振荡、离心、第一次过滤，获得土壤菌悬液；

S12、向土壤菌悬液中加入0.01g～0.1g石油，振荡培养7d，离心，获得待测菌，并用15mL缓冲溶液对待测菌进行1-3次离心清洗，最后向待测菌中加入20mL缓冲溶液，进行第二次过滤后，获得含有石油烃降解菌的待测菌悬液。

可选地，所述第一次过滤为定性滤纸过滤。

可选地，所述第二次过滤为5μm滤膜过滤。

可选地，所述缓冲溶液为：PBS缓冲溶液或pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液。

可选地，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液由0.22μm尼龙膜过滤后的二甲基亚砜、SYBR Green I染料和PI染料组成；

其中，所述二甲基亚砜、所述SYBR Green I染料和所述PI染料的体积比为79：1：20。

可选地，在所述步骤2中，所述DNA染色工作液与所述染色后的待测菌悬液的体积比为1：40。

可选地，在所述步骤2中，所述恒温避光染色的工作温度为35℃，工作时间为15min。

可选地，在所述步骤2中，所述恒温避光染色在恒温金属浴中进行。

可选地，在所述步骤3中，所述流式细胞仪的工作流速为1000-1500events/μl。

相较于现有技术，本发明提供的一种石油烃降解菌丰度的测定方法存在如下优点：