[发明专利]COG5基因敲除的人胚胎干细胞系、构建方法及应用

说明书

本发明公开了COG5基因敲除的人胚胎干细胞系、构建方法及应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞系chHES‑90中敲除COG5，并将其诱导为中脑神经元，为该基因病的研究提供了便利、可靠的实验模型；同时利用hESC的多向分化能力，也为研究COG5缺陷造成的多系统病变提供平台。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了COG5缺陷的人胚胎干细胞系，并将其诱导为中脑神经元作为细胞模型来进行研究，为该基因病提供了便利、可靠的实验模型。

技术领域

本发明涉及一种人胚胎干细胞系的构建，具体涉及COG5基因敲除的人胚胎干细胞系、构建方法及应用。属于基因工程技术领域。

背景技术

保守寡聚高尔基体(conserved oligomeric golgi，COG)复合物是高尔基体逆行运输的核心，负责将完成上一次功能的糖基转移酶重新定位到高尔基体扁平囊中。COG复合物由八个不同的亚基组成，COG1-4组成叶A，COG5-8组成叶B。叶A的缺失对细胞生存构成威胁，而叶B的障碍通常造成糖基化过程的异常。COG5和COG7相互作用的缺陷，不会扰乱叶B的稳定性，但对小泡转运和扁平囊中糖基的后期加工产生影响。

COG5缺陷的糖基化病，是一种常染色体隐性遗传病，基因突变致使蛋白的完全缺失导致疾病的发生。2009年Paesold-Burda报道了第一例COG5基因突变的病例。至今，共 7篇文章进行了报道。病人的临床症状主要包括发育迟缓、智力障碍、大/小脑萎缩、小头畸形、肌张力低下等。目前国际上暂无针对该基因病患者的有效治疗手段。由于人的神经细胞体外几乎无法获取，也不清楚糖基化异常对神经细胞造成了什么改变。利用COG5突变的动物模型或者细胞模型进行研究，是可能的研究手段。目前，国内外未查到COG5突变小鼠模型的报道，并且介于脑发育以及神经系统在小鼠和人类中的差异，小鼠脑细胞毕竟不能真实反映人脑细胞的情况，利用小鼠模型进行研究存在局限性。

近年来出现了许多基因组编辑技术，包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活物样效应核酸酶(TALENs)和RNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶系统。前两种技术使用内切酶催化域的拴系策略来模块化DNA结合蛋白，从而在特定的基因组位点诱导靶向DNA双链断裂(DSB)。相比之下，Cas9是一种由小RNA引导的核酸酶，通过PAM序列与靶DNA配对，代表了一种更容易设计、高度特异、高效的系统，非常适合于各种细胞类型的基因编辑。

CRISPR/Cas9是一种基因编辑系统。由引导RNA(sgRNA)引导Cas9核酸内切酶识别外源遗传元件上的PAM(NGG)序列并在其上游几个碱基处进行切割，由此刺激目标基因组位点上的双链断裂(DSB)来促进基因组编辑。一旦被Cas9切割，目标位点通常经历两条主要的DNA损伤修复途径：非同源末端连接(NHEJ)或同源修复(HDR)途径。在没有修复模板的情况下，DSB通过NHEJ过程重新连接，这会以插入/缺失(INDEL)突变的形式留下印记。发生在编码外显子内的INDELs可能导致移码突变和蛋白翻译提前终止，从而介导基因敲除。相同的CPRSPR/Cas9质粒，成功转染胚胎干细胞的效率远低于肿瘤细胞，同时位点的剪切效率不高，成功基因缺陷的细胞少；药物筛选、单克隆培养等都增加了编辑细胞的生长难度，同时需考虑这些过程对干细胞干性，核型等的影响。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，针对COG缺陷病缺少研究模型，提供COG5基因敲除的人胚胎干细胞系、构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、COG5基因敲除的人胚胎干细胞系的构建方法，具体步骤如下：

(1)先将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条sgRNA退火成单链，克隆到含有嘌呤霉素抗性和BsmBI内切酶的改良Lenti-CRISPR质粒中，得到含有sgRNA的载体 Lenti-CRISPR-COG5质粒；