[发明专利]一种麝香霉菌原生质体制备和再生方法

说明书

本发明细胞工程中丝状真菌原生质体制备与再生领域，公开一种麝香霉菌原生质体制备和再生方法。该方法包括如下步骤：a、活化菌体；b、制备种子培养液；c、细胞壁的酶解d、原生质体悬浮液的制备；e、原生质体的再生。本发明的有益效果在于确定了麝香霉菌ZJLQ024原生质体制备和再生的适宜条件,为麝香霉菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基础，提高了转化效率。

技术领域

本发明属于细胞工程中丝状真菌原生质体制备与再生领域，具体涉及一种麝香霉菌ZJLQ024原生质体制备和再生方法。

背景技术

麝香霉菌(Muscodor)是一类属于炭角菌科、可产生挥发性有机化合物(volatileorganic compounds，VOCs)的内生真菌。该类真菌产生的VOCs具有较强的生物活性，能抑制或杀死多种病原菌以及部分昆虫。由于该类真菌产生的VOCs具有抑菌性，且不与物体直接接触，因此在生产应用方面受到极大关注。但该类真菌产生的VOCs对菌株自身生长也具有一定抑制作用，使得菌株自身生长缓慢。运用根癌农杆菌介导的转化方法构建随机插入突变体库，对转化子进行筛选，找到生长速度明显高于野生型菌株的突变菌株，这是对其抑菌性及应用进行初步研究的基础。

由于麝香霉菌株ZJLQ024在常规培养基上不产孢子，因此对其进行遗传转化需要以原生质体作为受体。所以原生质体的制备和再生是其遗传转化过程中不或缺的一环。不同真菌以及不同菌株间的细胞壁组成及生物学特性方面都存在差异，因此制备原生质体的方法有所区别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种麝香霉菌原生质体制备和再生方法，可制备出制备率和再生率高的麝香霉菌的原生质体，为麝香霉菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基础，且大大缩短了研究所需时间，提高了转化效率。

本发明技术方案如下：

一种麝香霉菌原生质体制备和再生方法，其特征在于，包括下述步骤：

将保存有麝香霉菌ZJLQ024的冷冻保存管于室温中自然解冻，接种到PDA培养基黑暗培养，培养后将菌丝洗入PDB液体培养基中，振荡培养4～7d；

将摇床中培养的菌丝体用灭菌漏斗及滤纸过滤，取出菌丝，将其转移至用渗透压稳定剂配制的裂解酶中，并在水浴锅酶解2～5h；所述渗透压稳定剂为NaC、KC、山梨醇或蔗糖中的一种或多种；所述裂解酶为溶壁酶、崩溃酶、β-葡聚糖酶或复合酶中的一种或多种；

菌丝匀浆经无菌注射器过滤后，离心弃去上清，悬浮沉淀，用枪头轻轻的吹打，得到原生质体；

将制备好的原生质体涂布于再生培养基上，观察再生菌落数量。

进一步的，所述裂解酶为溶壁酶，浓度为10～30mg/mL。

进一步的，所述渗透压稳定剂为山梨醇，浓度为0.4～0.7mol/L。

进一步的，振荡培养的条件为25℃，160rpm，振荡培养的时间为6d。

进一步的，菌丝与裂解酶酶液的质量体积比为1:2。

进一步的，将菌块接种到PDA培养基，封口膜封口，25℃培养箱黑暗培养。

进一步的，将菌丝转移至用0.6mol/L的山梨醇配制的浓度为15mg/mL的溶壁酶中，于30℃水浴锅酶解4h。

进一步的，所述PDA培养基的配置方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉18％，纯水1000mL，121℃高压灭菌15min。

进一步的，所述PDB液体培养基的配置方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，纯水1000mL，121℃高压灭菌15min。