[发明专利]一种生物传感器及其制备方法和应用、检测ctDNA的电化学系统

说明书

本发明涉及ctDNA的检测技术领域，尤其涉及一种生物传感器及其制备方法和应用、检测ctDNA的电化学系统。本发明提供的包括基底电极和依次负载在所述基底电极表面的Au‑CP1探针层、HT层、CRSPR/Cas12a体系层和CP2探针/磁性共价有机骨架/Pd‑Au/MB层；所述CRSPR/Cas12a体系层包括crRNA、Cas12a、ssDNA和待检样品，所述CP2探针/磁性共价有机骨架/Pd‑Au/MB层包括磁性共价有机骨架和负载在所述磁性共价有机骨架的孔隙结构中的Pd‑Au和MB，还包括CP2探针；所述Pd‑Au中的Au与CP2探针中的巯基键合，该生物传感器便于携带，能够特异性检测ctDNA。

技术领域

本发明涉及ctDNA的检测技术领域，尤其涉及一种生物传感器及其制备方法和应用、检测ctDNA的电化学系统。

背景技术

肺癌是目前世界上公认的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，所以精准快速的早期诊断对于肺癌患者的临床治疗和预后具有极其重要的意义。在肺癌中有约80%是非小细胞肺癌（NSCLC），其恶性程度高，预后较差。临床研究表明，超过60%的NSCLC高表达表皮生长因子受体（EGFR），EGFR已被认为是治疗NSCLC的重要治疗靶点。大多数EGFR突变发生在18~21外显子中的酪氨酸激酶结构域。在大多数情况下，21号外显子突变（EGFR L858R）占这些突变的40%~45%。EGFR L858R对靶向药物，如吉非替尼或厄洛替尼等酪氨酸激酶抑制剂（TKIS）高度敏感，这些药物在肿瘤患者治疗中疗效显著。因此，在临床治疗中检测EGFR L858R突变对NSCLC治疗和预后是必要的。

目前，临床上EGFR基因突变检测的主要手段是对术后切除组织进行测序，这种方法有创伤且不能重复采样，因而具有很大的局限性。针对上述问题，液体活检技术则具有微创或无创的特性，同时能动态监测肿瘤变化情况和可重复取样等优点，具有强大的潜力和发展前景。

循环肿瘤DNA（ctDNA）是其中一类重要的液体活检肿瘤标志物，可全面反映肿瘤细胞的基因变异情况，能实时动态地反映出肿瘤细胞的发展和治疗过程中的变化，是一种高敏感、高特异、具备广泛应用前景的血液肿瘤标志物。研究结果显示，ctDNA EGFR基因的突变在NSCLC患者的敏感性和特异性分别为78%和100%。因此，EGFR L858R在EGFR-TKIS的治疗指导，疗效评估和预后评估中发挥重要作用，因此，ctDNA EGFR L858R是一种具备广泛应用前景的血液肿瘤标志物。

目前，NSCLC患者ctDNA EGFR的检测方法主要分为两大类：一大类为基于聚合酶链式反应PCR的检测方法；另一类是基于高通量测序的检测方法。这些方法虽然灵敏，但由于依赖于热循环扩增、昂贵的仪器设备和专业人员的操作，因此很大程度限制了检测方法的推广运用。为此，急需开发一种灵敏、特异、低成本、可床旁检测（POCT）的新方法。

近年来研究发现CRISPR/Cas系统具有独特的靶向性，为开发针对核酸为底物的生物传感器提供了全新的方向。CRISPR/Cas系统具有独特的靶向性，其中CRISPR/Cas12a系统的识别目标物可以是RNA也可以是DNA；当Cas12a蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引导下结合到靶标后会识别RNA或DNA目标，从而激活Cas核酸酶，并启动反式切割活性对附近的单链非靶向核酸不加区分地进行剪切，且能在3小时后仍能保持活跃。近两年来对于CRISPR/Cas的核酸检测体系大多是用荧光的方法对病毒或者miRNA进行了检测。荧光检测法需要较大的仪器，不利于携带。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种生物传感器及其制备方法和应用、检测ctDNA的电化学系统，所述生物传感器便于携带，且能够特异性检测ctDNA。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物传感器，包括基底电极和依次负载在所述基底电极表面的Au-CP1探针层、巯基乙醇层（HT层）、CRISPR/Cas12a体系层和CP2探针/磁性共价有机骨架/Pd-Au/MB层；