[发明专利]一种在免疫组织化学中检测VEGFR2蛋白表达的金纳米杆抗体复合体及其制备方法

说明书

本发明提供一种在免疫组织化学中检测VEGFR2蛋白表达的金纳米杆抗体复合体及其制备方法，本发明涉及体外诊断领域，特别是免疫组织化学诊断癌症标志物VEGFR2表达的领域，具体地说，涉及一种采用双重修饰聚乙二醇分子将VEGFR2抗体与杆状金纳米颗粒连接到一起，以增强原有VEGFR2抗体检测性能，最终实现组织切片中VEGFR2的表达测定，为肿瘤精准靶向治疗特定患者的筛选提供标准。本研究与传统的抗体免疫组化检测方法相比，对于VEGFR2阳性组织而言呈现更强的识别效果；对于VEGFR2阴性组织而言维持原有抗体检测方法的特异性。综上所述，金纳米杆VEGFR2抗体复合体在提升原有VEGFR2抗体灵敏度的同时保持了原有抗体的特异性，从而提高检测的准确性，为精准靶向治疗提供更加准确的患者入组标准。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种在免疫组织化学检测VEGFR2蛋白表达的金纳米杆抗体复合体及其制备方法。

背景技术

胃癌在中国的发病率和死亡率均居高不下。近年来发现VEGFR2作为新型药物靶点在2014年被FDA批准用于晚期胃癌的治疗。在雷莫芦单抗(抗VEGFR2单克隆抗体)研究中，通过RAINROW实验(二线治疗，雷莫芦单抗+紫杉醇vs顺铂+紫杉醇)，晚期胃癌的总生存期从7.4个月上升至9.6个月。另一项REGARD实验(二线治疗，雷莫芦单药vs顺铂)表明，雷莫芦单抗单药使用与顺铂相比中位数总生存期从3.8个月上升至5.2个月。基于以上结果，FDA批准雷莫卢单抗(Ramucirumab)以单药或者联合用药形式作为转移性或进展性胃癌的二线治疗方案。一项晚期胃癌的一线临床实验表明，雷莫芦单抗联合氟尿嘧啶虽然没有提高总生存期，但无进展生存期有明显上升，且患者生存质量大幅度改善。目前雷莫芦单抗正在尝试用于曲妥珠单抗耐药后的治疗，雷莫卢单抗+纳武单抗也在进行临床实验。研究表明36％-40％的胃癌患者高表达VEGFR2，除此之外，有研究表明VEGFR2表达信息对胃癌的生存期预测至关重要。

本专利对目前常见的免疫组织化学检测组织切片中VEGFR2表达的方法进行测试，发现该方法的检测强度较低，当提高抗体浓度时，检测特异性有一定下降。本研究在不改变识别序列的前提下(不更换抗体克隆)，采用杆状金纳米颗粒，发现检测强度有明显上升，而方法特异性没有变化。

发明内容

本发明的目的在于设计金纳米杆VEGFR2荧光抗体复合体的合成方法，该复合体较常规抗体，在免疫组化方法识别方面有明显提升，为VEGFR2的表达精准判读提供更高的灵敏度，为VEGFR2药物治疗方案的筛选提供依据。

本发明涉及体外诊断领域，特别免疫组织化学中癌症标志物VEGFR2检测领域，具体地说，涉及一种采用双重分子修饰的聚乙二醇分子将VEGFR2抗体与杆状金纳米颗粒连接到一起，以增强原有VEGFR2抗体检测效率，最终实现组织切片中VEGFR2的表达测定，为肿瘤精准靶向治疗特定患者的筛选提供标准。

一种在免疫组化方法中检测VEGFR2蛋白表达的金纳米杆抗体复合体，复合物由纳米金杆、VEGFR2抗体和双重修饰的聚乙二醇分子由共价化学键连接而成，其结构式为：

其中为金纳米杆(简写为AuNR)，为VEGFR2抗体(简写为Ab)，为双重修饰的聚乙二醇分子(简写为Peg)。

优选的，以HS-(PEG)n-COOH分子作为媒介，HS端以金硫键与金纳米杆AuNR相连，通过离心去除多余的Peg分子，之后将连接好的复合体AuNR-Peg与抗体Ab以肽键相连，最终形成复合体AuNR-Peg-Ab，合成具体路线图为：

优选的，所述HS-(PEG)n-COOH选用分子量为3-4KDa。

优选的，所述金纳米杆的规格为9-16nm直径×46-56nm长，负电，750-850nm最大光吸收。

优选的，VEGFR2抗体选用临床药用抗体——雷莫芦单克隆抗体。