[发明专利]抗萎锈灵草菇及其遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法，包括以下步骤：向裂解酶酶液中加入小块的草菇子实体酶解，收集所得原生质体；调整为适当浓度，依次加入STC溶液、含有抗萎锈灵基因的片段，以及PTC缓冲液，混匀，离心去除上清；加入CYM培养基，倒平板，培养18‑24h后；加铺含有4μg/ml萎锈灵的PDA培养基，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇。本发明方法提供一种不含外源物种DNA的草菇转化方法，并用此方法获得了亲本生物学特性维持较好、遗传稳定的抗萎锈灵草菇，使得使用杀菌剂萎锈灵来控制草菇培养料中的担子菌类杂菌成为可能。

技术领域

本发明属于食用菌分子育种领域，具体涉及一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法。

背景技术

目前，草菇栽培过程中由于培养料并非完全灭菌，经常会受到竞争性杂菌的污染。墨汁鬼伞、膜鬼伞等担子菌是草菇栽培过程中最常见的竞争性杂菌。草菇栽培过程中担子菌类杂菌的防治较难，它们喜高温、高湿，一般在草菇播种后一周或出菇后出现，一旦发生，会污染料面并大量消耗培养料中的养分和水分，从而影响草菇菌丝的正常生长和发育，致使草菇减产。

萎锈灵是一种杀菌剂，对担子菌有较强的抑制作用，对人和动物毒性很低。在草菇培养料中施加萎锈灵能杀灭墨汁鬼伞等杂菌，但由于草菇也属于担子菌类，施加萎锈灵会抑制草菇生长。因此需要开发抗萎锈灵草菇，使得在栽培中施加萎锈灵杀菌剂杀灭其他杂菌而不抑制草菇生长，这将提高草菇生产效率，降低生产成本。

萎锈灵的主要作用位点是琥珀酸脱氢酶的β亚基(SdhB)，β亚基上与萎锈灵耦合位点的氨基酸残基发生改变，可使萎锈灵无法与之结合而失去杀菌能力，真菌即获得对萎锈灵的抗性。

目前在香菇中通过直接合成的方法将SdhB蛋白第243位组氨酸的密码子CAC改造为亮氨酸的密码子CTC，构建了香菇的萎锈灵抗性基因，并通过农杆菌介导的遗传转化法将外源质粒转化进香菇菌丝获得了抗萎锈灵菌株，但其采用质粒作为载体含有外源物种DNA，并且双核菌株抗性在传代5代后抗性表型消失，表明抗性遗传不稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗萎锈灵的草菇及其遗传转化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

抗萎锈灵草菇的遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)配制质量体积浓度0.5-3％的裂解酶酶液，加入小块的草菇子实体，30-35℃酶解0.5-3.5h，收集所得原生质体；

步骤(1)所述的裂解酶酶液，其质量体积浓度优选2％，具体配制方法如下：

称取0.2g裂解酶(L1412 sigma aldrich)，加入250μl 0.2M pH值5.7的MES缓冲液、7.5ml 0.8M的甘露醇溶液、1.7ml ddH₂O，混匀；

(2)取步骤(1)所得原生质体，调整为适当浓度，依次加入STC(山梨醇-氯化钙)溶液、含有抗萎锈灵基因的片段，以及PTC缓冲液(聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液)，混匀，室温放置2-10min，离心去除上清；加入预冷的CYM液体培养基，混匀后加入CYM固体培养基中，倒平板，30-35℃培养18-24h后；加铺一层含有4μg/ml萎锈灵的PDA培养基，能够萌发的原生质体为抗萎锈灵的草菇；

步骤(2)中，所述原生质体浓度为(0.1-1.0)×10⁸/mL；

步骤(2)中，所述含有抗萎锈灵基因的片段，是将如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸连接到pMD18-T载体，采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，回收含有抗萎锈灵基因的片段。

一种抗萎锈灵的草菇，由上述遗传转化方法制得，含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：