[发明专利]一种生产蛋白激酶C抑制剂balanol的培养基及其方法

说明书

本发明提供一种生产蛋白激酶C抑制剂balanol的培养基及其方法，利用生物发酵法生产PKC抑制剂balanol的培养基。该培养基由蔗糖、酵母粉、多聚蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾组成。该方法通过将种子发酵液以接种量2％接种于高产培养基中，即250ml三角烧瓶装液量75ml，于26℃、转速150rpm下培养12天。本发明的发酵方法包括菌株活化、发酵种子培养和发酵优化。利用本发明提供的培养基发酵生产balanol，大大提高PKC抑制剂balanol的发酵单位。具有成本低廉，balanol产率高以及发酵单位稳定等优点。

技术领域

本发明属于微生物制药领域，涉及一种生产蛋白激酶C抑制剂balanol的培养基及其方法。是通过生物发酵法生产蛋白激酶C抑制剂balanol的高产培养基及其生产方法。

背景技术

balanol于1977年在大团囊虫草中首次被发现命名为ophiocordin，1993年在真菌Verticillium balanoides中被分离鉴定命名为balanol，在肿瘤靶向治疗药物筛选中发现其是一种强效PKC抑制剂，具有很强的PKC抑制剂活性和抗真菌活性，其三维结构与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)相似，其与蛋白激酶PKC和PKA的ATP结合口袋结合的亲和能力是ATP的3000 倍，而PKC和PKA是肿瘤治疗中的重要靶点。真菌中的balanol产物量极低，实验室条件下大团囊虫草菌中balanol基因簇处于沉默状态通过基因组测序和生物信息学分析，本课题组在大团囊虫草菌L1中经高表达调控因子BlnR,成功激活并分离鉴定到balanol。本发明中的生物合成方法高效，经济，对环境友好并且降低对自然资源逐渐匮乏的依赖。

为拓宽balanol的使用范围，此前诸多研究都是通过体外化学全合成获得balanol及其衍生物，而这些化学法合成通常需要激烈的有机反应环境、过程复杂、成本较高且对环境不友好。微生物来源的balanol发酵生产工艺安全，对环境相对友好，并且生产不受季节限制，易于工业化，并且利于其下游的分离纯化，因此与化学合成法相比，微生物发酵法生产balanol 具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产PKC抑制剂balanol的培养基，所述培养基的原料有：蔗糖、酵母提取物、多聚蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾，pH 4.9。

优选培养基为(g/L)：蔗糖105，酵母粉5，多聚蛋白胨13.6，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾0.6。

本发明的另一个目的是提供利用所述培养基生物发酵生产PKC抑制剂balanol的方法，所述方法包含以下步骤：

(1)将大团囊虫草菌菌株转接至PDA固体培养基上进行菌种活化；该菌株已保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.1146，分类命名：大团囊虫草Cordyceps ophioglossoides，保藏日期：2004年5月14日，保藏地址：中国北京。

(2)将活化后的大团囊虫草菌接种于初始培养基，于26℃、转速150r/min条件下培养4 天，获得种子发酵液；

(3)将步骤(2)中获得的种子发酵液接种于所述发酵高产PKC抑制剂balanol的培养基中，250ml的三角瓶装液量为75mL，接种量为2％，于26℃、转速150r/min条件下培养12天，获得高产的蛋白激酶C抑制剂balanol。

步骤(1)所述PDA固体培养基是马铃薯葡萄糖琼脂培养基，包含原料为(g/L)：马铃薯浸出液200,葡萄糖20，琼脂粉15。

步骤(2)所述初始培养基包含原料为(按培养基重量计)(g/L)：蔗糖30，酵母粉10，硫酸镁1.0，磷酸二氢钾0.5，pH 5.5。

测定生物量：测量balanol发酵单位和生物量，选取一定培养时间进行取样，最终发酵时间为12天结束培养，发酵液取样后将菌液10000rpm离心，弃上清，然后使用去离子水清洗两遍，烘干后称重得到生物量。