[发明专利]碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法

权利要求书

1.一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. 将荧光碳点与PBS溶液混合，浓度为150-250ug/mL；向荧光碳点溶液中加入线性化聚乙烯亚胺，将混合后的溶液在30-40℃搅拌0.5-1.5h；

b. 6000-8000rpm/min离心3-5min，将离心后的上清液加入到脱盐柱，并采用MES溶液进行洗脱，获得荧光碳点-线性化聚乙烯亚胺复合材料溶液；

c.向步骤b获得的荧光碳点-线性化聚乙烯亚胺复合材料溶液中加入siTnfα混匀，反应20-40min，获得荧光碳点-线性化聚乙烯亚胺-siTnfα复合材料；

d.将第三代骨髓间充质干细胞以1×10⁴-10⁵/孔的密度接种于细胞培养板，在37℃、5％CO₂条件下培养过夜，弃去培养基，加入无血清、双抗a-MEM培养基；

e.将步骤c获得的荧光碳点-线性化聚乙烯亚胺-siTnfα复合材料加入到含有骨髓间充质干细胞的细胞培养板上，转染后更换完全培养基。

2.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤a中，所述线性化聚乙烯亚胺的加入量为荧光碳点溶液体积的1/5-2/5。

3.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤b中，将荧光碳点-线性化聚乙烯亚胺复合材料溶液采用0.22μm 膜过滤。

4.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤c中，siTnfα的终浓度为100ng/ml。

5.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤c中，siTnfα选用巯基修饰的siTnfα。

6.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤d中，骨髓间充质干细胞的分离培养方法如下：在无菌条件下用含有肝素抗凝剂的干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓悬液并用D-Hanks液稀释，在离心管加入Ficoll分离液，将稀释后的骨髓悬液缓慢加在Ficoll分离液上，1500-2000 rpm/min离心10-20分钟，收集富含有核细胞的界面层细胞并用D-Hanks液清洗，调整细胞浓度为 1×10⁴-10⁵/ml接种于的培养瓶，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下静置培养。

7.根据权利要求1所述的一种碳点介导siTnfα调控炎症促进间充质干细胞软骨分化的方法，其特征在于：步骤d中，骨髓间充质干细胞的传代方法如下：细胞长至瓶底的 80%-90%进行传代，用无菌 PBS 冲洗细胞后加入 0.25%胰蛋白酶液，消化1-2min后终止消化，吹打悬浮细胞，收集悬液，1200-1500rpm/min离心5-8min，弃上清；采用完全培养基重悬细胞于培养瓶中，2-3 天传代一次。