[发明专利]一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种特异性表达人源性SIRPG的转基因小鼠的构建方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR-Cas9基因敲入技术插入外源基因hSIRPG，具体步骤为：根据小鼠插入位点序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA；并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA，gRNA和供体质粒显微注射到小鼠受精卵中；取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，获得转基因小鼠；其中，所述外源基因hSIRPG的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gRNA的DNA序列为5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源基因由CAG启动子驱动，在启动子和外源基因之间包含一段受Cre重组酶条件性控制的STOP序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组酶为Cre重组酶。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述外源基因hSIRPG和荧光报告基因之间通过P2A自切割肽段链接，所述P2A自切割肽段的核苷酸序列为：GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGTCCT。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述荧光报告基因编码绿色荧光蛋白zsGreen，其序列如SEQ ID NO:5所示。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述hSIRPG基因的5’端带有kozak序列，所述kozak序列为5′-GCCGCCACC-3′；所述小鼠为C57BL/6JGpt 背景的小鼠。

9.权利要求1-8任意一项的方法构建的转基因小鼠的应用，其特征在于：将构建所得的转基因小鼠与Kras ^LSL_G12D/+小鼠交配，得到hSIRPG^LSL_KI/-+Kras ^LSL_G12D/+转基因小鼠，经鼻腔注射Cre病毒，诱导转基因小鼠肺部hSIRPG的表达以及Kras突变，观察hSIRPG敲入后转基因小鼠存活时间；解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况；

在KRAS^G12D/++SIRPG^KI/+转基因小鼠Cre病毒注射8周后，每隔一天注射中和抗体，然后解剖小鼠肺组织，取出称重并进行HE染色，观察肿瘤形成情况并作统计。

10.权利要求1-8任意一项的方法构建的转基因小鼠的应用，其特征在于：所述转基因小鼠用于下述的至少一项：

(1)观察hSIRPG基因敲入对转基因小鼠一般生理功能，尤其是免疫功能的影响；

(2)观察hSIRPG基因敲入后对肿瘤组织微环境免疫细胞浸润的影响；

(3)探索靶向hSIRPG后肿瘤生长抑制的具体机制；

(4)用于hSIRPG单克隆抗体的研究；

(5)用于探究更多hSIRPG基因功能的研究。