[发明专利]一种树舌转基因方法

说明书

本发明公开了一种树舌转基因方法，属于生物领域，首先制备培养基，包括包括YPG培养基、MYG再生培养基，然后构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303‑pGPD‑FIP‑gap，然后取纯化后的1×10⁷个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303‑pGPD‑FIP‑gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；所述PEG缓冲液包括PEG6000、15mM CaCl₂和10mM Tris水溶液，经过再生培养、潮霉素抗性筛选、传代培养后最后进行检测，结果显示经过两次潮霉素抗性筛选的转化子均为阳性，PCR阳性检测结果：10％‑60％的PEG缓冲液均可得到阳性转化子，其中用30％的PEG缓冲液进行树舌转化效率最好，1μg质粒可以获得110‑120个左右阳性转化子，阳性转化率可达95％。

技术领域

本发明涉及一种转基因方法，尤其是一种树舌转基因方法。

背景技术

树舌灵芝具有清热消炎、保肝护肝、治疗心脑血管疾病和强身健体的作用。近年来在树舌灵芝发现多种药用活性物质，例如多糖、甾类、三萜、脂类化合物、氨基酸、蛋白质、酚类和一些微量元素。树舌灵芝多糖是抗血脂异常及其相关并发症的活性物质。目前树舌主要研究在分离提纯生物活性物质体外检测。分子生物学和遗传转化等方面研究未见报道。由于树舌亚属与其他灵芝属亲缘性较远，遗传背景不尽相同。已有的灵芝遗传转化方法并不完全适用树舌灵芝。本专利拟发明一种树舌的PEG介导的遗传转化方法，将有助于研究树舌灵芝生物学功能，遗传育种和其他多种研究。

发明内容

本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，而提供一种树舌转基因方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种树舌转基因方法，其中，首先制备培养基，包括：

YPG液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄1g/L；

YPG固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄1g/L，琼脂粉15g/L；

MYG液体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，甘露醇109g/L；

MYG固体再生培养基：葡萄糖5g/L，麦芽糖13g/L，酵母粉4.5g/L，琼脂粉15g/L，甘露醇109g/L；

上述培养基在110℃下灭菌30min。

具体步骤如下；

(1)克隆赤灵芝内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(pGPD)和克隆树舌灵芝真菌免疫调节蛋白基因FIP-gap，分别连接至真核表达载体pCAMBIA1303上，构建重组真核表达质粒载体：pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap；

(2)将野生树舌灵芝接种于含有潮霉素的YPG固体培养基，记录野生树舌生长情况时间梯度为：6、12、18天，筛选潮霉素对树舌的最低抑制浓度，作为后续实验转化子的筛选浓度，浓度梯度：10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL；目的是为了确定潮霉素抗性筛选时适用用的浓度；

(3)取纯化后的1×10⁷个树舌原生质体，悬浮于250μL渗透压稳定剂，加入5μg质粒pCAMBIA1303-pGPD-FIP-gap轻轻摇匀，然后放置于冰上冰浴10min；

接着加入50μL PEG缓冲液，置于冰上冰浴30min，再加入1mL的PEG缓冲液，混匀在28℃下静置20min；