[发明专利]B7-H4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用

说明书

本发明提出了B7‑H4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用，属于生物工程技术领域。B7‑H4蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1.B7‑H4蛋白表达鉴定；S2.B7‑H4蛋白表达纯化；S3.B7‑H4蛋白验证本发明制得的B7‑H4蛋白对于过度免疫反应及细胞因子风暴具有很好的抑制效果，试验证明，B7‑H4蛋白抑制小鼠和人CD8+T细胞分泌细胞因子。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及B7-H4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用。

背景技术

很多严重的感染，如新冠病毒，SARS，HIV等，会造成细胞因子风暴(cytokinestorm)的出现，从而导致疾病恶化，变成危重症患者。这是免疫反应过度导致，病人会因此出现低血压、凝血障碍、多器官功能衰竭等并发症，最终导致患者死亡。同样的，用于预防白血病患者在接受骨髓移植后的急性移植物抗宿主病 (GvHD)，也可以出现上述免疫反应过度的情况，包括脏器移植，如肝移植、心肺移植等。另外，使用免疫检查点抑制剂(Immunecheckpoint inhibitors，ICIs) 包括程序性死亡受体蛋白-1(PD-1)抑制剂、程序性死亡受体配体-1(PD-L1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂，因有良好的抗肿瘤活性，在晚期肿瘤的治疗中已成为标准方案之一。ICIs通过阻断PD-1/PD-L1和CTLA-4 两类主要的免疫检查点通路，解除它们的“免疫刹车”作用，从而激活及强化机体的免疫系统(主要为T细胞系统)，发挥抗肿瘤能力。但过度激活的免疫系统可对靶器官、组织造成损伤，从而发生免疫相关的不良事件(irAEs)。这种情况也有免疫过度的发生。自身免疫疾病、代谢综合征也会导致细胞因子风暴。

抑制细胞因子风暴这种过度的免疫反应常使用的就是糖皮质激素。大剂量激素冲击治疗所引发的后遗症(股骨头坏死)是一个非常麻烦的问题。因此，急需发现一些新的方法可以安全的抑制该类过度免疫反应。

外泌体(exosomes)是一种细胞分泌的微小膜泡，广泛分布于各种体液中，外泌体可以携带多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等信息，形成一种细胞-细胞间的信号传递。B7-H4(也称为B7x、B7-S1和VTCN1)是与其他B7家族成员(包括PD-L1) 具有同源性的免疫调控分子。它是由IgV和IgC胞外结构域组成的I型跨膜蛋白。 B7-H4以外泌体的形式给药，从而可以直达细胞因子风暴的中心。

发明内容

本发明的目的在于提出B7-H4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用，试验证明，B7-H4蛋白可以使抑制小鼠和人CD8+ T细胞分泌细胞因子，抑制其功能。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种B7-H4蛋白在制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用。

本发明进一步保护一种含B7-H4蛋白的药品，所述药品的给药途径为皮肤/ 黏膜外用、静脉注射、肌肉注射、口服、雾化吸入以及以包含该蛋白的外泌体吸入。

本发明进一步保护一种B7-H4蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1.B7-H4蛋白表达鉴定；

S2.B7-H4蛋白表达纯化；

S3.B7-H4蛋白验证。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述B7-H4蛋白表达鉴定包括：

(1)获得B7-H4基因cDNA片段：通过特异性扩增引物设计，PCR扩增以及 cDNA片段纯化回收，获得B7-H4基因cDNA片段；

(2)双酶切：用内切酶同时对B7-H4基因cDNA片段和质粒进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再进行cDNA片段纯化回收；