[发明专利]用于基因片段连接的应用方法和试剂盒

说明书

本发明属于生物酶应用技术领域，具体涉及用于基因片段连接的蛋白酶的核酸序列。本发明还涉及用于基因片段连接的方法，所述方法包括用于基因片段连接的蛋白酶的核酸序列。本发明还涉及用于基因片段连接的试剂盒，所述试剂盒包括用于基因片段连接的蛋白酶的核酸序列。本发明还涉及针对用于基因片段连接的蛋白酶在对具有不同序列特征，不同片段大小以及不同片段数量的基因片段进行连接的过程中的应用。使用本发明的用于基因片段连接的方法和试剂盒，能够特异、高效、快速，较准确地进行microRNA基因片段，高GC含量的基因片段以及多个长基因片段的连接及基因克隆。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于基因片段连接的蛋白酶的核酸序列，用于基因片段连接的方法，用于基因片段连接的检测试剂盒以及用于基因片段连接的蛋白酶在对具有不同序列特征，不同片段大小以及不同片段数量的基因片段进行连接的应用。

背景技术

目前大量的方法在研究多个片段快速连接，为生物合成等领域提供相应解决方案。传统的酶切和连接克隆法一直受限于需要选择适当的或者通用的外切酶和连接酶而不能高通量用于载体构建，同时整个连接过程中包括了酶切位点的选取，酶切消化，连接，之后才可进行转化，操作步骤也较为繁琐。目前T5核酸外切酶被广泛的应用于多片段连接，但应用此核酸外切酶进行片段连接时，步骤繁琐，前期需要先针对待连接的片段进行一步体外酶切，然后进行体内连接，才可进行转化。其原理为T5核酸外切酶从双链DNA 分子的5端去除核苷酸，形成单链粘性末端，待连接片段的互补的单链末端退火粘合，后使用PhusionDNA 聚合酶以及Taq DNA连接酶修复已完成重组的双链DNA链上的空隙(gap)和断裂的缺口(nick)。利用碱性磷酸酶和T4DNA多聚酶进行连接的方法，优势在于其一步连接(克隆)，不需要进行体外酶切和体内序列的空隙(gap)和断裂的缺口(nick)修复，但是此方法需要专门设计特定的引物，此引物缺失某个特定的核苷酸，也就是说对线性化后待连接的载体两端的一定长度内的序列有要求(缺失某个特定的核苷酸)，同时插入片段需要在两端引入与载体一致的同源序列(缺失某个特定的核苷酸)，从而为碱性磷酸酶和T4DNA多聚酶提供识别位点。然而本发明涉及的突变了一个核苷酸碱基的T4DNA多聚酶基因片段所构成的蛋白酶，利用本发明涉及的连接方法，不需要限制性内切酶消化，连接酶连接，不引入多余序列，同时插入片段两端的序列不需要特别设计(即不需要缺失某个特定的核苷酸)，可快速，高效完成基因片段的连接。即直接使用本发明中的蛋白酶同时处理含有15-22bp同源序列的插入片段和载体后，冰上放置 8-10分钟然后直接做转化即可。同时此方法也是多片段一步快速连接的高效选择。总结本研究：对DNA多聚酶的基因序列进行了基因工程改造，突变了此基因片段的一个碱基序列，由碱基“T”突变为碱基“G”，将此改造后的序列构建到表达载体上，然后在大肠杆菌中表达并纯化出此改造后的蛋白酶，本法通过检测验证，证明可以利用此蛋白酶一次便可完成单一插入片段，两个插入片段，三个插入片段同时进行高效，快速的连接，且阳性克隆数最低为70％，并且最快30秒即可完成整个反应进行转化，具有成本低，高效，快速的优势，目前未见到报道有任何DNA多聚酶可达到此效率。同时所优化的方法对构建载体大小为17k，片段大小为5k的基因克隆其连接效率也可达到80％以上，目前未见有报道蛋白酶可用于10kbp以上的片段连接及基因克隆。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供准确，高效，快速进行基因片段连接的蛋白酶的核苷酸序列。

本发明的另一个目的在于，提供准确用于基因片段连接的方法。

本发明的另一个目的在于，提供准确用于基因片段连接的试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供基因片段连接的蛋白酶序列在对具有不同序列特征，不同片段大小以及不同片段数量的基因片段进行连接的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：