[发明专利]一种APEX2基因敲入的小鼠动物模型、构建方法及其应用

说明书

本发明首次提供了APEX2基因敲入小鼠动物模型及其构建方法。通过APEX2基因敲入小鼠与不同类型Cre小鼠的杂交，可实现对小鼠体内特定组织/细胞的成像、蛋白质组的标记与捕获，极大地推动了蛋白质组学、医学、药学等交叉学科的发展。

技术领域

本发明涉及动物模型领域，更为具体的，本发明涉及一种APEX2基因敲入小鼠动物模型、构建方法以及其在成像、标记和捕获活体内特定组织和/或细胞蛋白质组中的应用。

背景技术

蛋白质组学是在全局框架下研究蛋白质互作、信号通路、及网络调控，在基础研究与临床转化中发挥重要作用。传统蛋白质组的研究依赖于将蛋白质从细胞或组织中分离出来，而后进行质谱鉴定——这导致了蛋白质体内原位信息的丢失，也成为限制蛋白质组学在生命科学与医学领域发展的一大瓶颈。

细胞的生命活动及病变过程依赖于体内微环境，体内条件下的细胞研究也是最理想、最真实的实验模型。如能在体内状态下破译细胞的蛋白质组，则能为基础研究、临床转化、药物筛选等方向提供宝贵的数据资源。APEX是化学家在植物中发现的一种过氧化物酶，经改造，可将周围的蛋白质特异标记biotin标签，实现对标签蛋白的富集与鉴定。但目前APEX的应用仅局限在体外生化实验或细胞层面，在体内的研究与应用一直处于空白。如能将APEX引入至体内研究领域，将实现体内蛋白质组技术，同时促进化学、生命科学、医学领域的交叉发展。

发明内容

为填补现有技术的空白，本发明提供一种APEX2基因敲入动物模型、该模型的制备方法及其应用。

本发明的第一个方面，提供一种APEX2基因敲入小鼠动物模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：

（1）将特异性靶位点导向RNA（gRNA）和Cas9体外转录成mRNA，获得有活性的gRNA和Cas9 mRNA；优选的，所述gRNA的核苷酸序列为CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT；

（2）构建loxP-Stop-loxP-APEX2-EGFP 基因敲入的打靶载体；

（3）将有活性的gRNA、Cas9 mRNA和打靶载体共同注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；

（4）提取F0代小鼠尾部组织DNA，PCR扩增、测序，获得loxP-Stop-loxP-APEX2-EGFP基因阳性F0代小鼠；

（5）使用性成熟的阳性F0代小鼠与野生型异性小鼠交配，获得F1代小鼠；

（6）提取F1代小鼠尾部组织DNA，经PCR扩增、测序及Southern杂交鉴定，获得F1代杂合子小鼠；

（7）将F1代杂合子小鼠近交获得F2代loxP-Stop-loxP-APEX2-EGFP 基因敲入纯合子小鼠，即为APEX2基因敲入小鼠动物模型。

可选的，在一种实施方式中，上述的构建方法所述的gRNA、Cas9 mRNA、以及打靶载体的用量根据试剂操作常规选择。

可选的，在一种实施方式中，使用如下引物对小鼠尾部组织DNA进行短链PCR扩增，从而鉴别小鼠的基因型：

F3引物：5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’

R3引物：5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’

F5引物：5’-GCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG-3’。

可选的，在一种实施方式中，所述loxP-Stop-loxP-APEX2-EGFP 基因敲入的打靶载体序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第二个方面，提供一种由上述方法构建获得的APEX2 基因敲入小鼠模型。