[发明专利]一种α-鹅膏蕈碱人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

说明书

本发明提供了一种α‑鹅膏蕈碱人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，属于食品安全免疫检测领域。以α‑鹅膏蕈碱与高碘酸钠反应得到具有醛基的产物为半抗原，并与载体蛋白偶联，得到完全抗原，得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株，此细胞株分泌的单克隆抗体，同时对α‑鹅膏蕈碱和β‑鹅膏毒肽具有较好的检测灵敏度，IC₅₀值分别为0.5ng/mL和1ng/mL，可实现对食品中α‑鹅膏蕈碱和β‑鹅膏毒肽残留量的检测，为食品中α‑鹅膏蕈碱和β‑鹅膏毒肽残留的免疫检测提供了原料，对于食物中毒的毒源鉴定、蘑菇中毒预防和中毒后的针对性治疗具有实际应用价值。本发明合成步骤简洁有效，完全可用于免疫分析中。

技术领域

本发明涉属于食品安全免疫检测技术领域，尤其是指一种α-鹅膏蕈碱人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术

在全球范围内，每年报告数千起蘑菇中毒事件，因此蘑菇食物中毒一直以来是我国重点关注的食品安全问题之一。大约80％的蘑菇中毒涉及未知的蘑菇种类。大多数致命病例归因于含有毒素的蘑菇。鹅膏毒肽(amatoxins，AMA)是一个双环八肽家族，在极端温度、pH值、烹饪或人体消化酶作用下不会失活。引起毒性的主要毒素是鹅膏毒素，最显著的是α-鹅膏毒素(α-AMA)和β-鹅膏毒肽(β-AMA)。它们是RNA聚合酶II的有效抑制剂，与RNA聚合酶Ⅱ的RBP1亚基结合形成一个复合体,使RBP1亚基降解，导致mRNA转录、阻止真核生物中的蛋白质合成。新鲜蘑菇中活性鹅膏毒素的人体LD50(估计为主要有毒鹅膏毒素的总含量)被认为约为0.1mg/kg。

此外，鹅膏毒肽引起的食物中毒易误诊且缺乏针对性治疗，因此早期诊断对于鹅膏毒肽中毒的救治尤为重要。

目前α-鹅膏蕈碱和β-鹅膏毒肽的检测方法主要分为仪器分析方法，包括毛细管电泳法(CE)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)等。其中LC-MS/MS能实现毒素的高通量精确分析而成为目前最主要的方法。已有的方法具有灵敏度高，检测限低，可比性和重复性好等优点,但存在检测通量低、假阳性、灵敏度低和基质效应严重等问题，严重限制了其在实验室以外作业中的应用。

因此制备α-鹅膏蕈碱抗体，建立免疫分析检测方法快速而有效地检测样品中的α-鹅膏蕈碱和β-鹅膏毒肽对于食物中毒的毒源筛查、蘑菇中毒注意事项和中毒后的康复治疗具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种α-鹅膏蕈碱人工抗原、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。

一株分泌α-鹅膏蕈碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株FML，保藏编号为CGMCC No.22336，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种α-鹅膏蕈碱的半抗原，所述半抗原的结构式为：

在本发明的一个实施例中，所述的α-鹅膏蕈碱的半抗原的制备方法，包括以下步骤：将α-鹅膏蕈碱溶于有机溶剂中，加入高碘酸钠水溶液，室温避光搅拌反应得到所述α-鹅膏蕈碱的半抗原α-AMA。

在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为DMF或DMSO。

在本发明的一个实施例中，所述α-鹅膏蕈碱与高碘酸钠质量比为2-8：5-30。

将α-鹅膏蕈碱的半抗原α-AMA溶液加入载体蛋白，室温黑暗搅拌。最后，加入硼氢化钠(NaBH₄)(0.1M，在10mM氢氧化钠溶液中)，下在黑暗中搅拌；然后用PBS溶液透析，除去未反应的α-鹅膏蕈碱的半抗原，得到α-鹅膏蕈碱包被原/免疫原(α-AMA-SP-Pro/α-AMA-SP-Pro)。