[发明专利]用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法

说明书

本发明公开一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。按照源头控制、过程防范的原则，采用物理清洗+复合抗生素药浴法，去除细胞系源藻上附着的杂藻和微生物；微细管法分离并建立单配子细胞系，进一步减少杂藻污染概率；定期药浴和营养加富，清除细胞系培养过程中的微生物。本发明从配子释放、细胞系建立、细胞系扩培到发育诱导各环节，系统性防控杂藻和微生物，以净化细胞系。一方面有利于细胞系长期保存和健康快速生长；另一方面为附苗后长时间地静止培养，减少杂藻滋生，提供了条件。无污染的细胞系是萱藻细胞工程苗种繁育的根本保证。

技术领域

本发明属于海藻栽培技术领域，具体涉及一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。

背景技术

萱藻(Scytosiphon lomentaria)，隶属褐藻门(Phaeophyta)、萱藻科(Scytosiphonaceae)、萱藻属(Scytosiphon)，分布于温带地区沿岸海域，是一种泛温性大型海藻。富含氨基酸、岩藻多糖、类胡萝卜素、膳食纤维等营养成分，长期以来就是沿海居民喜爱的美食。萱藻还具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化活性，尤其在抗血小板凝聚和抑制血栓方面作用独特，是纯天然的保健品及海洋药物原料。此外，作为一种近岸海域的大型藻类，是海洋生态环境中的重要初级生产力，在海洋牧场物质供应、营养盐调控及海洋生物栖息场提供等方面发挥着重要作用。因此，开展萱藻人工栽培，既是提供产品创造经济效益的需要，也是光合固碳、降低海水生源要素，改善海洋环境的需要。“细胞系建立—细胞系扩增—细胞系发育诱导—幼苗—养成”的技术工艺是一种运用细胞工程技术的萱藻栽培方法，具有能耗低、出苗稳定的特点，具有广泛的应用前景。

萱藻细胞工程苗种繁育就是根据植物细胞全能性原理，建立萱藻细胞系，将细胞系直接诱导成苗种进行培育的过程。无污染的细胞系是该体系的关键，一是有利于细胞系长期保存和健康快速生长；另一方面为附苗后长时间地静止培养，减少杂藻滋生，提供了条件。用于放散配子建立细胞系的种藻，通常附着大量的杂藻和微生物，是细胞系的污染源。这些杂藻和微生物在细胞系长期的培养过程中能够大量繁殖，不仅掠夺培养液中的营养物质，还会分泌有害的次生代谢产物，从而抑制细胞系的生长。因此，在萱藻细胞工程苗种繁育中，细胞系建立、细胞系培养以及生殖诱导各环节需要采取无损净化技术去除杂藻和微生物。

发明内容

为达到萱藻细胞系净化的目的，本发明提供了一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，包括如下步骤：

(1) 种藻采集：采集成熟健康的萱藻叶状体，剪取具有配子囊的藻段，无损净化处理。

(2) 配子放散和附着：在超净工作环境下，阴干刺激藻段，放散配子，于培养皿中完成附着。

(3) 细胞系建立和净化：分离单配子细胞系，培养后镜检，剔除污染细胞系。

(4) 细胞系培养：在细胞系扩增培养和发育诱导过程中，定期药浴并冲洗，去除微生物。

用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，具体步骤的实现方法如下：

在上述步骤(1)中种藻的采集方法为：1) 选择成熟健康、具配子囊斑的萱藻叶状体，海水冲洗表面附着的杂质，鲜活运至实验室。2) 剪取带有配子囊斑的藻段3-5 cm，使用灭菌脱脂棉和海水充分擦洗，擦洗过程中勤换脱脂棉。