[发明专利]水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用

权利要求书

1.水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻中的应用，其特征在于，定点突变水稻中的OsHPP04基因，获得OsHPP04基因纯合突变；所述OsHPP04基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述定点突变采用CRISPR/Cas9技术。

3.一种基于CRISPR/Cas9技术编辑水稻感病基因OsHPP04在培育抗根结线虫病水稻的方法，其特征在于，构建含OsHPP04基因sgRNA序列的CRISPR/Cas9植物表达载体，通过农杆菌介导的转基因体系在水稻中定点突变OsHPP04基因，获得OsHPP04功能缺失的水稻植株。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.设计敲除OsHPP04基因的靶点sgRNA序列；

S2.将步骤S1中得到的sgRNA序列构建到CRISPR/Cas9植物表达载体中；

S3.将步骤S2中得到的植物表达载体通过根癌农杆菌整合到水稻基因组中；

S4.通过步骤S3将农杆菌介导的水稻愈伤组织转化，获得的愈伤组织进行抗性愈伤组织筛选和分化，获得转基因水稻植株；

S5.将步骤S4中获得的转基因水稻植株进行筛选和鉴定，确定突变体植株；

S6.将步骤S5获得的突变体植株进行脱靶检测，筛选出无脱靶效应的纯合突变植株；

S7.将步骤S6获得的纯合突变植株进行根结线虫抗性测定，即能筛选出抗根结线虫病的水稻植株。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S1中采用的靶点sgRNA包含gRNA1和gRNA2，其序列依次如SEQ ID NO.16～17所示。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中CRISPR/Cas9植物表达载体的构建方法为：采用Overlapping PCR的方法，第一轮PCR分别以pYLsgRNA-U6a和pYLsgRNA-U6b为模板，将gRNA1引入OsU6a启动子下游和sgRNA序列的上游、gRNA2引入OsU6b启动子下游和sgRNA序列的上游；第二轮PCR分别以稀释10倍后的第一轮PCR产物为模板，将启动子、靶点和sgRNA骨架构建成完整的表达盒，接着再将gRNA1和gRNA2表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体上，获得重组植物表达载体pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H-OsHPP04 KO。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中采用的引物为：U-F、gR-R、OsHPP04-gRT1、OsHPP04-OsU6aT1、OsHPP04-gRT2、OsHPP04-OsU6bT2、Pps-R、Pgs-2、Pps-2和Pgs-L，所述引物序列依次为SEQ ID NO.1～10所示。

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S4中水稻愈伤组织转化的黑暗培养条件为25～35℃，2～25d。

9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S6中脱靶检测是采用高保真酶扩增各潜在脱靶位点区域片段，将纯化后的PCR产物进行测序分析脱靶情况。

10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S7中根结线虫抗性测定方法是采用活体接种法。