[发明专利]一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法

说明书

本发明属于医学实验模型研究技术领域，针对目前自身免疫性肝炎的严重性以及细胞模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，公开了一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。通过采用刀豆蛋白A诱导小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7巨噬细胞株，并将RAW 264.7巨噬细胞株与BRL3a小鼠肝细胞共培养，在体外模拟自身免疫性肝炎发病过程中巨噬细胞对肝细胞造成炎性损伤的过程，建立了巨噬细胞/肝细胞共培养模型。弥补了自身免疫性肝炎细胞模型研究的空白，将自身免疫性肝炎的发病过程进行分解，聚焦巨噬细胞诱导肝细胞损伤的机制，有助于自身免疫性肝炎发病机制研究，以及治疗药物的筛选。

技术领域

本发明属于医学实验模型研究技术领域，具体为一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。

背景技术

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)系由异常自身免疫反应所介导的肝实质炎性病变，可引发肝硬化及肝衰竭，全球总患病率介于4.0-42.9例/10万人·年，不同肤色及年龄段人群均可罹患。AIH患者的10年累积死亡率为正常人群的2.29倍(32.3％vs14.1％)；若合并肝硬化或门脉高压，患者的死亡风险显著升高。重症AIH患者需进行肝移植以维持生命。据报道，1995年至2014年间，美国和英国进行肝移植的AIH患者占全部肝移植患者的3.2％和3.6％。因此，AIH被认为是除病毒性肝炎外，又一种严重危害人类健康的肝脏炎性疾病。本病的病因以及发病机制尚不清楚，目前认为是由于遗传易感性及环境诱发因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失，从而诱导产生以T细胞和巨噬细胞介导为主的针对肝脏抗原的免疫反应，造成肝脏组织的破坏及炎症的形成。

设计和建立符合人类发病过程的实验模型(包括用于在体内研究的动物模型和用于体外研究的细胞模型)是深入研究自身免疫性肝炎发病机制的基础。自身免疫性肝炎动物模型的相关研究持续了近半个世纪，已有部分动物模型得到了学界的公认。但由于自身免疫性肝炎的免疫炎性反应主要发生在肝脏，肝脏免疫微环境较为复杂，诱发自身免疫性肝炎的因素众多。对本病发病机制的研究仍需在细胞水平进行深入探讨，如研究某一个基因参与自身免疫性肝炎发病过程的机制，需对该基因进行沉默或过表达，通过回复实验，以证实该基因是否参与本病的发生发展；又如，探讨某种药物是否对自身免疫性肝炎肝损伤具有调控作用时，有必要探讨该药的作用靶点，同样需要体外细胞实验数据的支持。

研究发现，在自身免疫性肝炎发病过程中，巨噬细胞除可作为抗原呈递细胞参与诱导T细胞活化外，还可直接参与肝脏炎性损伤过程。因此，如果能够建立一种稳定的、易于复建且符合自身免疫性肝炎发病过程的“通过诱导巨噬细胞活化从而介导肝细胞损伤”的细胞模型，将大大地推进自身免疫性肝炎发病机制的研究进程。

发明内容

针对目前自身免疫性肝炎的严重性以及细胞模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，本发明提供了一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，包括以下步骤：

步骤1，巨噬细胞的诱导活化；

步骤2，建立巨噬细胞和肝细胞共培养模型。

进一步，所述巨噬细胞为小鼠RAW 264.7巨噬细胞，肝细胞为小鼠BRL3a肝细胞。

进一步，所述巨噬细胞和肝细胞共培养细胞模型包括巨噬细胞和肝细胞间接共培养细胞模型、巨噬细胞和肝细胞直接共培养细胞模型。

进一步，所述步骤1中巨噬细胞通过刀豆蛋白A诱导活化。

更进一步，所述通过刀豆蛋白A诱导活化巨噬细胞的具体过程为：24孔板按照每孔1×10⁶/个RAW 264.7巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μL高糖DMEM培养基后，分别加入0-320μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A在37℃下诱导巨噬细胞0-24h。