[发明专利]一种荧光适配体探针及其在microRNA/ctDNA核酸分子检测中的应用

说明书

本发明公开了一种荧光适配体探针及其在microRNA/ctDNA核酸分子检测中的应用。所述荧光适配体探针Dye‑dsDNA‑Aps的结构为：在microRNA或ctDNA的适配体（Ap）上连接附加链dsDNA，并在附加链dsDNA的双链结构中嵌入大量荧光分子（Dye）。Dye‑dsDNA‑Aps中的Aps端可通过氢键和π‑π键等相互作用，吸附于纳米猝灭剂表面，并导致其Dye‑dsDNA端发生荧光猝灭；当目标microRNA或ctDNA存在时，Dye‑dsDNA‑Aps中的Aps端与microRNA或ctDNA形成双链结构，进而导致双链结构的Dye‑dsDNA‑Aps从纳米荧光淬灭剂表面释放，并使Dye‑dsDNA端的荧光信号复燃。本发明操作方便，具有高灵敏性特点，在核酸检测应用方面具有良好的前景。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于检测microRNA/ctDNA核酸分子的荧光适配体探针。

背景技术

循环游离核酸（包括循环肿瘤DNA和microRNA），已被证实密切相关许多生命过程，包括细胞增殖、分化、衰老和凋亡。因此，循环游离核酸可作为各种疾病（如癌症、神经退行性疾病、糖尿病和免疫系统病理学）的诊断和预后生物标志物。例如，miR-21与肿瘤的增殖、凋亡和侵袭有关，已被用作肿瘤治疗和诊断的生物标志物；持续上调的miR-155不仅导致持续的炎症反应，又可促进肿瘤的发生。而该类核酸物质在血液系统中的表达水平普遍很低。到目前为止，已经开发出检测 miRNA 的技术，包括聚合酶链反应 (PCR)、微阵列分析和使用放射性标记探针的RNA印迹分析。然而，由于miRNA序列短，序列相似度高，表达水平低，miRNA 的检测仍然面临挑战。开发简单、灵敏、特异的microRNA和ctDNA定量检测方法仍然是一个挑战。

对于miRNA/ctDNA的荧光传感，核酸适配体通常用于设计基于纳米荧光淬灭剂的荧光传感器。荧光团标记的核酸适配体通过静电或π-π相互作用吸附在纳米荧光淬灭剂上，导致荧光团的荧光猝灭（信号“关闭”）；在存在目标miRNA/ctDNA的情况下，由于双链寡核苷酸的形成，适体从纳米荧光淬灭剂中释放出来，从而允许荧光团的荧光恢复（信号“开启”）。但是，由于通常情况下设计的核酸适配体探针只标记一个荧光基团，所以其荧光强度较弱，不利于检测。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于检测microRNA/ctDNA核酸分子的荧光适配体探针（Dye-dsDNA-Aps），通过在microRNA或ctDNA的适配体上连接附加链dsDNA，由于附加链dsDNA可以嵌入大量荧光分子，从而增强适配体探针的荧光强度。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种荧光适配体探针，包括核酸适配体和附加链dsDNA，所述附加链dsDNA连接在核酸适配体的一端或两端；

所述附加链dsDNA的双链结构内嵌入有荧光分子。

进一步地，所述附加链dsDNA为碱基数目在5-20之间的双链DNA。

更进一步地，所述附加链dsDNA为5′-3′TCTCAGAG、5′-3′TCTCAGAGCG或5′-3′CCTCTCAGAG。

进一步地，所述荧光分子选自SYBR Green I、TOTO-1、YoYo-1或吖啶橙。

上述荧光适配体探针在microRNA或ctDNA检测中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。