[发明专利]一种重组蛋白DspB-SNa5及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 202111336749.X | 申请日： | 2021-11-12 |
| 公开（公告）号： | CN114107254A | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 谢浩;肖澜;郭君慧;李其昌;蒋嘉峰 | 申请（专利权）人： | 武汉理工大学 |
| 主分类号： | C12N9/24 | 分类号： | C12N9/24;C07K19/00;C12N15/70;A61K38/47;A61K38/17;A61P1/02;A61P31/02;A61P31/04 |
| 代理公司： | 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 | 代理人： | 乔宇 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 重组 蛋白 dspb sna5 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种重组蛋白DspB-SNa5的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)首先设计引物对质粒pET28a[DspB]进行反向PCR；
(b)对步骤(a)所得产物进行消化、纯化，构建得到重组质粒pET-28a[DspB-SNa5]；
(c)重组质粒pET-28a[DspB-SNa5]经IPTG诱导表达后纯化、超滤后获得重组蛋白DspB-SNa5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)具体为：对质粒pET28a[DspB]进行反向PCR的引物为SNa5 F1为5’-GATGAAGAAGATGATGATGAAGAACACCACCACCACCACCACTG-3’，SNa5 R1为5’-CATCATCATCTTCTTCATCATCATCTTTTTCAAACTGCGGATGGGACCACATC-3’。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述反向PCR条件为：第一阶段：94℃预变性3分钟；第二阶段：94℃变性30秒，65℃退火30秒，68℃延伸6分40秒，9个循环，每个循环退火温度递减1℃；第三阶段：94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸6分40秒，9个循环；第四阶段：68℃延伸10分钟。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)消化过程为：向反向PCR后的载体体系加入3.4μl Dpn I buffer与1μl Dpn I，37℃消化1h；纯化过程按PCR产物纯化消化试剂盒进行，获得重组质粒pET-28a[DspB-SNa5]。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)中所述具体过程为：含重组质粒pET-28a[DspB-SNa5]的过夜菌液扩大培养至OD600为0.4～0.8后，经IPTG诱导表达培养，离心收集菌沉淀，然后加入细胞裂解液重悬，超声破碎细胞，分离上清液，纯化超滤得到重组蛋白DspB-SNa5。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的诱导剂IPTG终浓度为0.2mmol/L，培养条件：37℃培养3h，离心条件：6000g，4℃离心10min，细胞裂解液：20mM Tris，300mMNaCl，pH＝8。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述扩大培养中的接种比为1：50；所述的超声破碎细胞为：将细胞破碎液经10000g，4℃离心20min；所述的纯化超滤为：所述上清液经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化，之后使用pH为6的PB溶液洗涤、30kDa超滤管超滤，获得重组蛋白DspB-SNa5。
8.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的重组蛋白DspB-SNa5在降解生物膜的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌培养形成的生物膜体系中，加入重组蛋白DspB-SNa5液，37℃处理1h，降解生物膜。
10.权利要求1所述的制备方法制备得到的重组蛋白DspB-SNa5在抑制磷酸钙相矿化，进而抑制羟基磷灰石生成的应用。
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