[发明专利]一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒、制备方法和应用

权利要求书

1.一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，其特征在于：其为三层结构，最内层是铁螯合剂DFO，其中间层为脂质体，由大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比(3-4):2:1制备而成，用以包裹最内层铁螯合剂DFO，最外层包裹血小板膜，DFO脂质体与血小板膜的比例为1 mL:1.0-2.0×109个血小板的膜，血小板-DFO脂质体纳米颗粒中，DFO含量为5-15mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种血小板-DFO脂质体纳米颗粒，其特征在于：粒径100~200nm。

3.一种如权利要求1或2所说的血小板-DFO脂质体纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、血小板膜的制备

试剂配制：

HEPE 缓冲液（HEPE buffer）：

按照质量比NaCl：KCl：HEPES：EGTA为1:(0.02-0.03):(0.1-0.2):(0.2-0.3) 的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成HEPE 缓冲液；

洗涤缓冲液（wash buffer）：

按照质量比NaCl:EDTA:dextrose:柠檬酸钠为1:(0.03-0.04):(1.0-1.2):(0.3-0.4)的比例溶解于水中，调节pH至7.0-8.0，制成洗涤缓冲液；

台式缓冲液（Tyrode’s buffer）：

按照质量比NaCl:NaHCO₃:KCl:Na₂HPO₄:MgCl₂:HEPES为1:(0.1-0.2):(0.02-0.04):(0.005-0.007):(0.01-0.02):(0.3-0.4)的比例溶解于水中，之后按照体积比PEG:PMSF:水为1:1:10000的 比例加入PEG和PMSF并调节pH至7.0-8.0，制成台式缓冲液，备用；

制备过程：

（1）选用成年大鼠或小鼠，通过心脏取血的方式取血，加入抗凝剂后将血液收集至管内；

（2）收集血液后0-4 h内处理并收集血小板，全血加HEPE buffer以10:1比例进一步抗凝；

（3）80-100 g离心，15-20 min，取上清得富含血小板的血浆；

（4）700-1000 g离心，15-20 min，取沉淀；

（5）加红细胞裂解液（5:1），低温裂解5-10 min，重复步骤（4）；

（6）加入wash buffer重悬沉淀，重复步骤（4）；

（7）用Tyrode’s buffer或水重悬沉淀，用计数仪对收集的血小板计数；

（8）反复冻融3次，-80℃-常温循环，超声破碎处理后得到血小板膜（PNV）；

步骤二、Platesome-DFO的制备

（1）将大豆卵磷脂：胆固醇：mPEG-DSPE-2000按质量比（3-4）:2:1溶解在装有3-5 mL无水乙醇的茄形瓶中，45-50 ℃水浴，转速60-70 r/min，旋蒸10-20 min，直至无水乙醇全部蒸出，且烧瓶底为均匀的薄膜；

（2）向茄形瓶内加入浓度20-50 mg/mL的 DFO生理盐水溶液1-2mL进行水化，同时加入3-6个玻璃珠，在超声清洗仪的帮助下水化2-5 min，直至瓶壁上的膜全部洗脱在溶液中，得到DFO脂质体（Liposome-DFO）；

（3）将制备的脂质体用挤出器挤出后超滤，条件3000g，30min，加生理盐水再离心30min，再加盐水，离心50min，取出脂质体，加入步骤一制备的PNV（约含有1.0-2.0×10⁹个血小板），用生理盐水重悬沉淀，之后用挤出器进行共挤出，挤出时依次通过400 nm、200 nm的滤膜，反复挤出后得到Platesome-DFO成品。

4.一种如权利要求1或2所述的的血小板-DFO脂质体纳米颗粒的应用，其特征在于，制备成静脉注射液、胶囊、口服液、滴丸、喷鼻剂任意一种，作为治疗缺血溶栓后的一种药物应用。