[发明专利]用于合成橄榄醇酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法

说明书

本发明涉及一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是TKS基因和OAC基因联合基因TKS/OAC，其序列如SEQ ID NO.2所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还涉及包含有所述构建体的载体和包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法。TKS基因与OAC基因的联合基因TKS/OAC会将蓝藻光合作用产生的丙二酰辅酶A和己酰辅酶A催化合成橄榄醇酸。本发明以蓝藻为底盘生物进行改造合成橄榄醇酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低。

技术领域

本发明涉及合成生物技术领域，具体而言，涉及一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法。

背景技术

蓝藻(Cyanobacteria)可以进行厌氧型光合作用的大型单细胞原核生物，可以进行光合作用并以水为电子受体进行放氧。它的发展使整个地球大气从无氧状态发展到有氧状态，从而孕育了一切好氧生物的进化和发展。蓝藻作为碳固定场所，可以固定大气中的CO₂(一定程度上减轻CO₂过多引起的环境问题)。集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803)是一种单细胞球形蓝藻，能利用光能进行自养生长，又能利用葡萄糖进行异养生长。

蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium，Blue-green algae)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻Synechocystis sp.PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一。

橄榄醇酸(OLA)是一种来源于III型聚酮合成酶(PKS IIIs)催化作用的植物次生代谢物，与其戊烯基化衍生物一起具有多种药理活性。单芳化合物橄榄醇酸(OLA)是PKSIII产品类的一员，具有抗菌、细胞毒性和光保护等药理活性。此外，橄榄醇酸是合成一类重要的药理化合物的中心中间体，因为它在大麻类化合物的生物合成过程中充当烷基间苯二酚部分，这类产品因其众多的药理性质而变得越来越重要。

目前，橄榄醇酸及其衍生物的生产主要是通过从植物中直接提取，但由于植物生长缓慢，这些化合物的积累至少需要几个月的时间，直接提取的周期较长。虽然植物生物技术提供了改善本地物种天然产物合成的机会，但精确控制转基因在植物中的表达水平并适应工业化生产是困难的。虽然橄榄醇酸的化学合成是最近报道的另一种选择，但大多数天然产物的结构复杂性决定了全化学合成固有的低效率，这导致了低产率和高能源浪费。与这些方法相比，建造微生物细胞工厂来生产这些增值的植物天然产物是一个很有前途的策略。

发明内容

针对现有技术中的不足，本申请首次成功地构建生物合成橄榄醇酸的蓝细菌所需的构建体。载体和菌株，并验证该构建方法具有良好的可行性，提供了一种在蓝细菌中生产橄榄醇酸的方法，该方法具有产量高，无污染，生产周期短，成本低且环保的优点。

为解决上述问题，本发明提供一种用于合成橄榄醇酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的第一基因和第二基因，其中第一基因是丁烯酮合成酶基因和橄榄醇酸环化酶基因联合基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，第二基因是酰基活化酶基因，其序列如SEQ ID NO.3所示。

可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。