[发明专利]一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞冻存液，由以下重量份的成分组成：勃脉力A复方电解质注射液75‑85份、菊花新炔A1.5‑5份、羟乙基淀粉2‑4.5份、白芨多糖胶1‑5份、草酰乙酸0.5‑3份、谷胱甘肽5‑8份、青霉素0.1‑0.5份。本发明提供的冻存液，通过冻存液中菊花新炔A、羟乙基淀粉、白芨多糖胶、草酰乙酸等成分间协同作用，在不添加DMSO和人血白蛋白的情况下实现骨髓间充质干细胞的长期冻存，复苏后的细胞存活率较高。本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液，并限定了冻存液中原料的添加顺序，有助于各成分在冻存过程中更好的发挥作用，提高细胞冻存的效率。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有强大的增殖能力和分化能力，且免疫源性低，具有广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞是目前应用最多的间充质干细胞之一。骨髓间充质干细胞具有取材方便，在体外培养能保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，植入体内无免疫排斥反应，易于临床应用等特点，是组织工程中理想的种子细胞。

骨髓间充质干细胞在体外经扩增培养后可以用于临床及各种科研实验，其间制备好的细胞不可避免的需要冷冻保藏备用。目前，骨髓间充质干细胞冻存使用的冻存液含血清和二甲基亚枫(DMSO)，如专利201910270339.6中提供的骨髓间充质干细胞冻存液中添加大量的人血白蛋白注射液和DMSO，低温保存干细胞主要依靠抗冻液DMSO和血清的保护。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，引起细胞内蛋白变性，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。由于血清的组分非常复杂、来源和生产批次存在差异可能会造成不良或不一致的影响，质量不稳定，血清中富含各种细胞因子、激素和其他活性成分，容易对干细胞的生物特性产生干扰和影响，并且血清的价格昂贵，增加科研成本。因此，近年来对无血清干细胞冻存液的开发和探索也越来越受到重视。研究一种长期低温保存骨髓间充质干细胞的冻存液对于促进骨髓间充质干细胞的研究和应用具有重大意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种骨髓间充质干细胞冻存液，不添加DMSO和人血白蛋白，成分稳定安全，为骨髓间充质干细胞的冻存提供保障。

本发明的目的之二在于提供一种骨髓间充质干细胞的冻存方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种骨髓间充质干细胞冻存液，由以下重量份的成分组成：勃脉力A复方电解质注射液75-85份、菊花新炔A1.5-5份、羟乙基淀粉2-4.5份、白芨多糖胶1-5份、草酰乙酸0.5-3份、谷胱甘肽5-8份、青霉素0.1-0.5份。

进一步地，所述骨髓间充质干细胞冻存液由以下重量份的成分组成：勃脉力A复方电解质注射液80份、菊花新炔A3.5份、羟乙基淀粉3份、白芨多糖胶2份、草酰乙酸2.5份、谷胱甘肽6份、青霉素0.3份。

进一步地，所述白芨多糖胶通过以下方法制备：取白芨块茎粉碎后烘干，加入10倍体积的70-80%的乙醇回流提取2次，每次回流提取时间为3h，取100目滤布过滤后收集滤液，在-0.1MPa，50℃条件下浓缩至无醇味，冷冻干燥得到白芨多糖胶。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种骨髓间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液进行冻存。

上述骨髓间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：取勃脉力A复方电解质注射液加入菊花新炔A、羟乙基淀粉、草酰乙酸、谷胱甘肽、青霉素，向上述混合液中加入需要冻存的骨髓间充质干细胞，分装在冻存管中，降温至4-8℃后加入白芨多糖胶，然后以2-3℃/min降温至-80℃，预冻存10-12h，完成后转移至液氮中保存。

进一步地，冻存液中骨髓间充质干细胞的浓度为1-10×10⁷个/mL。