[发明专利]一种外周血T细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种外周血T细胞的培养方法，包括以下步骤：（1）采集外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞；（2）向培养瓶中加入包被液包被过夜，弃去包被液，作为诱导培养瓶备用；（3）将步骤（1）的外周血单个核细胞采用诱导培养基重悬，在步骤（2）的培养瓶中培养2‑3天，完成诱导培养；（4）向培养瓶中添加包被液包被过夜，弃去培养液，作为增殖培养瓶备用；（5）将步骤（3）完成诱导培养的细胞加入步骤（4）的培养瓶中，采用增殖培养基培养，连续培养12天，即完成。本发明提供的培养方法，先用诱导培养基对外周血单个核细胞进行诱导培养，再采用增殖培养基对细胞进行扩增，得到的T细胞活性好，数量多。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种外周血T细胞的培养方法。

背景技术

癌症一直是困扰人类的巨大难题。虽然手术治疗、化疗、放疗等治疗方式可以较大改善癌症患者的生存率，但这些疗法对于解救全球上千万的癌症患者却远远不够。随着生物技术的飞速发展，肿瘤免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法，它可以弥补传统疗法的弊端，被认为是21世纪肿瘤综合治疗模式中最有发展前途的治疗手段。

细胞免疫疗法是一种新型且具有显著疗效的生物治疗技术，这种利用改造自身免疫抗癌的新型治疗方法，主要是运用生物技术和生物制剂对患者采集的自身的免疫细胞进行体外培养和改造然后回输到患者体内的方法，来激发识别和引导免疫杀伤肿瘤细胞从而增强机体自身免疫功能，达到治疗肿瘤的效果。在基因修饰免疫细胞治疗领域，CAR-T疗法(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)、TCR-T疗法(T细胞受体修饰的T细胞疗法)已经成为近年的研究热点。

T细胞来源于骨髓的多能干细胞。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。

现有的细胞免疫治疗中的T细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有 T细胞的培养基主要是由基础培养基、自体血浆(或动物血清)和各种因子培养组成，培养得到的T细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了T细胞在免疫细胞治疗中的应用。

因此，提供一种可以在短周期内大量高效培养T淋巴细胞，且又保持肿瘤杀伤能力的培养方法，变得十分的必要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外周血T细胞的培养方法，不添加自体血浆和动物血清，成分安全，有效的提高的T细胞的体外增殖效率。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种外周血T细胞的培养方法，包括以下步骤：

（1）采集外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞；

（2）向培养瓶中加入含二丁酰环磷酸腺苷、人CD3单克隆抗体的生理盐水作为包被液，在37℃，5%CO₂条件下包被过夜，弃去包被液，作为诱导培养瓶备用；

（3）将步骤（1）的外周血单个核细胞采用诱导培养基重悬，在步骤（2）的培养瓶中培养2-3天，完成诱导培养，所述诱导培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的螺旋藻多糖、尿囊素、丙酮酸钠、IFN-γ、白介素-2、白介素-12组成；

（4）向培养瓶中添加含环吡酮、人CD3单克隆抗体的生理盐水作为包被液，在37℃，5%CO₂条件下包被过夜，弃去培养液，作为增殖培养瓶备用；

（5）将步骤（3）完成诱导培养的细胞加入步骤（4）的培养瓶中，采用增殖培养基培养，连续培养12天，即完成，所述增殖培养基的组成为：基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：枸橼酸铋钾、甲壳素、柚皮苷、白介素-2、转化生长因子-α。