[发明专利]核酸甲基化胞嘧啶转化方法

说明书

本发明提供了一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，其特征在于其步骤包括：（1）对DNA或RNA样本进行TET酶氧化处理；（2）在反应体系中加入吡啶硼烷处理；（3）磁珠回收反应系统中的DNA或RNA。本发明的核酸甲基化胞嘧啶转化方法整个过程只包括TET酶氧化、吡啶硼烷处理和DNA磁珠回收3个步骤，不仅提高了TAPS的转化效率，而且简化了TAPS的操作难度和流程，我们将其命名为eTAPS（Enhanced TET‑assisted pyridine borane sequencing）。eTAPS具有转化率高、DNA损伤小、操作简单、自动化方便等优点，此外我们发现eTAPS在RNA胞嘧啶甲基化上也具有高效灵敏的检测效率。这表明eTAPS技术在核酸甲基化检测上具有重要价值，尤其在肿瘤早筛和疾病诊断领域。

技术领域

本发明专利涉及一种核酸甲基化胞嘧啶转化方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学领域的重要研究方向。胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA上最常见的修饰碱基，占所有胞嘧啶的1%-8%，有些特定的胞嘧啶位点如细菌的Dam甲基化位点或真核生物的CpG岛中的胞嘧啶位点发生甲基化修饰的比例可高达近100%，因此5mC也被称为“第五种碱基”。DNA甲基化是细菌识别区分内外源DNA的主要方式，是细菌识别自身的身份标记。近年来，大量研究表明DNA甲基化水平异常与肿瘤发生、恶化和细胞癌变进程有着密切的联系。因此，血液的cfDNA甲基化检测是临床上进行肿瘤早筛的重要手段，具有很高的灵敏度和特异性。RNA胞嘧啶甲基化（5mC）是RNA上常见的核酸修饰，存在于各种RNA分子中，包括tRNA，rRNA，mRNA和非编码RNA（ncRNA）。 在mRNA和ncRNA中至少发现了10,275个5-mC候选位点，覆盖了转录组中总胞嘧啶残基的10.6％。RNA胞嘧啶甲基化对RNA的命运具有直接的决定性作用，参与到免疫、分化、细胞通讯等各种复杂细胞进程。因此，核酸甲基化检测在生理病理上都具有重要的应用价值。

目前市面上用于检测胞嘧啶甲基化位点和水平的产品主要分为两种：一种是重亚硫酸盐转化试剂盒，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶通过脱氨反应转变成尿嘧啶，再使用耐尿嘧啶的DNA聚合酶通过PCR扩增将尿嘧啶转变成胸腺嘧啶。最终达到将未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶的效果，而发生甲基化的胞嘧啶位点不会发生改变。但这种方法会导致严重的DNA损伤（约90%的DNA会发生断裂），且具有较高的假阴性，影响了甲基化检测的灵敏度和准确性。第二种是酶转化法试剂盒（EM-seq），其原理是先利用TET酶将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5caC，再利用APOBEC脱氨酶将未甲基化的C通过脱氨反应转变成U，最后通过PCR转变成T。这种方法对DNA的损伤小，能够检测低至10 ng的DNA样本中的甲基化位点和水平。但是这种方法具有较高的假阳性和假阴性，且操作较为复杂。此外，DNA甲基化检测方法需要将所有的未甲基化胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，这影响了测序数据的质量和比对准确性。