[发明专利]基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法

权利要求书

1.基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、备料；

S2、对材料进行处理：

2.1.1LPS处理A549细胞；

人II型肺泡上皮系A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（1、2.5、5、10、20）μg/mL组，处理A549细胞24h；2、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组，分别处理12h、24h、36h，收集细胞，待用；

2.1.2GsMTx4对LPS诱导的A549细胞损伤的干预作用；

A549细胞设置为：1、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组、LPS+GsMTx4（Pizol1抑制剂GsMTx42μg/mL预处理1h后与LPS2.5μg/mL共培养24h）组、GsMTx4（2μg/mL）组；2、PBS组、LPS（2.5μg/mL）组、LPS（2.5μg/mL）+PD98059（10μmol/mL）组、PD98059（10μmol/mL）组，24h后收集细胞上清及细胞以备后续实验；

2.2、实验动物及处理；

动物伦理申明：

8-10周龄、体重20-22g的C57/BL小鼠于实验室条件饲养：恒温20~24℃，自由饮水，标准饲料喂食，光照周期12h照明与12h黑暗交替进行；约7d待小鼠适应环境后，进行实验；动物实验严格按照实验动物管理条例进行，实验操作符合苏州大学动物伦理学要求；

2.2.1LPS诱导小鼠ALI模型；

C57/BL小鼠设置为：1、NS组、LPS组；采用腹腔注射脂多糖（LPS）诱导ALI模型，LPS的浓度为5mg/kg，NS组注射等体积生理盐水（NS），24h后留取肺组织和血清标本；

2.2.2腹腔注射GsMTx4对LPS诱导的ALI小鼠的干预作用；

C57/BL小鼠设置为：NS组、LPS组、LPS+GsMTx4组、GsMTx4组，腹腔注射LPS诱导ALI模型，NS组注射等体积NS，LPS+GsMTx4组为GsMTx4270μg/kg腹腔注射预处理1h后腹腔注射LPS，GsMTx4组为注射GsMTx4270μg/kg，24h后留取肺组织和血清标本，其中LPS的浓度为5mg/kg；

2.2.3、标本采集；

4%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，室温静置90min，于1500×g离心15min，制备血清，取左肺滤纸吸干表面血液，用于测定肺组织湿/干比；取右上肺置于4%多聚甲醛中进行固定，待HE染色；取右肺中叶及下叶液氮瞬时冷冻后于-80℃冰箱保存，待提取蛋白及mRNA；

S3、RT-PCR检测基因表达；

C57/BL小鼠腹腔注射LPS或NS24h后，LPS的浓度为5mg/kg，取右肺组织100mg，用Trizol试剂提取各组样总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA，根据试剂盒提供的方法进行实时定量PCR反应检测各组mRNA水平，GADPH作为内参；循环条件设置：预变性95℃2min，95℃5s、60℃反应40个循环，相对基因表达水平以GADPH作为内参基因，用2^−ΔΔCT方法测定；

S4、Western blotting检测蛋白表达；

A549细胞或小鼠在处理24h后，RIPA试剂从细胞或小鼠肺组织提取各组样本总蛋白，BCA试剂盒定量，根据定量结果，以20μg/孔的上样量进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度100mL/L，采用半干转膜法转移蛋白至硝酸纤维素膜，封闭液室温封闭，2h后加入相关一抗；４℃冰箱中孵育过夜，第2天使用TBST缓冲液清洗3次后，加入对应二抗，室温孵育2h，ECL显色液曝光显影，凝胶成像仪分析蛋白相对表达，实验结果用ImageJ图像处理软件测定蛋白条带灰度值；

S5、ELISA检测TNF-α和IL-1β炎症因子水平；

A549细胞或小鼠在处理24h后，ELISA法检测细胞上清液或血清TNF-α和IL-1β炎症因子浓度，检测方法按照ELISA试剂盒进行；

S6、血清LDH水平测定；

小鼠在处理24h后，收集血清，全自动生化分析仪测定小鼠血清LDH水平，所有操作均按照操作说明进行；

S7、HE染色小鼠肺组织及病理评分；

小鼠在处理24h后，用4%多聚甲醛固定肺组织样24h，采用乙醇脱水，石蜡包埋，然后切片，切片厚度为5μm；切片进行HE染色并进行肺损伤评分；

S8、免疫组化法和免疫荧光检测小鼠肺组织Piezo1表达；

小鼠在处理24h后，将肺组织标本经10%中性福尔马林液固定，常规脱水、石蜡、包埋，3-5μm厚切片，抗原修复，抗体孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，显微镜观察染色强度，行半定量分析；免疫荧光参考免疫荧光试剂盒说明书制作，切片行激光共聚焦显微镜下观察拍片；

S9、检测小鼠BALF中总蛋白及细胞总数：气管插管行肺泡灌洗获取肺泡灌洗液，回收的肺泡灌洗液离心后，吸取上清液，BCA法检测总蛋白水平；去掉BALF的上清液后，其细胞团块打散后用PBS重悬，计数总细胞数；

S10、肺组织湿/干质量比；

检测取左肺，用滤纸吸干肺组织表面水分，称湿质量（W），置于70℃烘箱48h至恒重后测定干质量（D），计算肺组织湿/干质量比（W/D）；

S11、Tunel染色检测肺组织细胞凋亡；

A549细胞或小鼠在处理24h后，按照Tunel细胞凋亡试剂盒提供的方法，对切片进行染色封片，光学显微镜观察细胞凋亡状况；

S12、NC-GsMTx4BSA/壳聚糖纳米粒子的制作；

采用脱溶技术制备BSA/壳聚糖纳米粒子：将50mg的牛血清白蛋白（BSA）溶于5mL的ddH₂O中，磁力搅拌器均匀混合溶液；微量泵以2mL/min的速度泵入20mL无水乙醇，持续搅拌过夜；微量泵2mL/min的速度泵入20mL壳聚糖溶液（1mg/mL，1%乙酸溶液配制），再以0.5mL/min的速度泵入5mL无水乙醇，均匀搅拌10h，即得到壳聚糖稳定的BSA纳米粒子载体（nanoparticle carry，NC）；高速离心机以12000r/min的速度离心20min后收集，收集后的纳米粒子用50%的乙醇溶液清洗2-3遍；

将50ul1μg/μl的GsMTx4溶液加入5mL10mg/mL的BSA溶液中，余步骤按照上述步骤执行，可得到包裹GsMTx4的BSA/壳聚糖纳米粒子载体（NC-GsMTx4），4℃保存以备使用；

S13、NC-GsMTx4的表征及生物学作用；

13.1透射电镜TEM和扫描电镜SEM；

用无水乙醇将NC-GsMTx4纳米粒子充分混匀，混合液滴加至爬片上，再放入37℃烘箱干燥后，通过离子溅射仪镀膜，处理好的样品在HitachiSU-8010型扫描电镜中观察；将NC-GsMTx4纳米粒子放进无菌的去离子水混匀5分钟，让其自由游动形成混悬液；混悬液滴加在铜网1-2%的磷钨酸（PTA，pH6.5-7.0）染色5-10s后，在H-7650型透射电镜中观察；ImageJ的软件进行上述数据读取分析，计算直径分布；

13.2体外生物学作用；

将30mLF-12培养基分别与100mgNC-GsMTx4和NC纳米粒子充分混合均匀，4℃静置24h，12000r/min离心20min，取上清液后过滤除菌，并按照比例加入10%FBS和1%双抗，配液成含有NC或NC-GsMTx4释放成份的F-12完全培养基，4℃保存以备使用；

根据是否含有NC或NC-GsMTx4释放成份的F-12完全培养基以及LPS处理，A549细胞设置为：1、NC组、NC-GsMTx4组、LPS（2.5μg/mL）+NC组、LPS（2.5μg/mL）+NC-GsMTx4组；共培养24h后，各组细胞多聚甲醛固定液固定进行Tunel染色及定量分析；2、NC组、GsMTx4组、LPS（20μg/mL）组、LPS（20μg/mL）+GsMTx4组、LPS（20μg/mL）+NC组、LPS（20μg/mL）+NC-GsMTx4组，共培养24h后，CCK-8检测细胞增殖活力，操作方法参考CCK-8试剂盒步骤；

S14、NC-GsMTx4的生物相容性检测；

C57/BL小鼠设置为：NS组、NC组、NC-GsMTx4组；分别称取100mgNC、NC-GsMTx4纳米粒子分别用20mL生理盐水稀释，各组小鼠雾化吸入1mLNS、NC、NC-GsMTx4，正常饲养，24h后收集肺、心脏、肝脏、肾脏组织行HE染色；

S15、雾化吸入NC-GsMTx4对LPS诱导的急性肺损伤 （ALI）小鼠的干预作用；

C57/BL小鼠设置为：1、NC组、LPS组、LPS+NC组、LPS+NC-GsMTx4组，腹腔注射LPS（5mg/kg）造模，NC组注射等体积的生理盐水；称取100mgNC、NC-GsMTx4纳米粒子分别用20mL生理盐水稀释，造模后4组小鼠分别立即雾化吸入1mLNC、NS、NC、NC-GsMTx4混合液，24h后收集肺组织、肺泡灌洗液、血清；2、NC组、LPS组、LPS+NC组、LPS+NC-GsMTx4组，以LPS5mg/kg的剂量连续3d腹腔注射诱导肺损伤后肺纤维化模型，对照组注射等体积的生理盐水；称取100mgNC、NC-GsMTx4纳米粒子分别用20mL生理盐水稀释，实验第1d分别雾化吸入NC、NS、NC、NC-GsMTx4混合液，实验第7d收集肺组织及血清；

S16、统计；

数据分析采用SPSS统计软件，数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的基于纳米粒子靶向Piezo1蛋白在急性肺损伤中的应用方法，其特征在于，在S10中，置于70℃烘箱48h至恒重后测定干质量（D）时，测定干质量（D）时需要测定2次，2次测定值差需小于0.05mg。