[发明专利]叶斑艺兰花RCA基因的应用及其载体构建方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开叶斑艺兰花RCA基因的应用及其载体构建方法，通过将叶斑艺兰花RCA转入铁皮石斛中RCA基因能够正常表达，过量表达RCA基因能够增加转基因铁皮石斛中多糖含量，所述RCA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，过量表达RCA基因能够很大程度的提高增加转基因铁皮石斛中蛋白质含量、可溶性糖含量增加，光合色素含量增加，叶绿体发育良好；而敲除原球茎则无法正常发育，没有叶绿体的存在。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及叶斑艺兰花RCA基因的应用及其载体构建方法。

背景技术

中国的野生兰科植物非常丰富，但是野生兰科植物均被列为濒危植物的保护范围中，人们对奇特叶形、花型、花色兰花的需求日益增长。兰花经过长期的选育栽培，出现了很多的变异品种，根据观赏部位的不同，分为花艺、叶艺两大类型，其中的叶斑艺兰花起源于中国，在近些年中逐渐被人们认识。所谓叶艺即是指兰花的叶片上发生的性状相对稳定的变异，包括叶片色彩和叶片形状的变化。传统上的叶艺兰主要是叶片颜色发生变化，大多分为水晶艺兰、斑艺兰、线艺兰三个大类，其中，线艺兰即是指兰花的绿色叶片上出现的黄色或白色等长短不一、粗细各异的条状艺色斑纹，依据线条分布的位置以及形状的不同，大致可以分为爪艺、边艺、缟艺、中透艺。形成叶艺的原因有很多，例如环境发生变化、病毒入侵、某些营养缺乏等等，这些原因使得叶片上出现嵌合的斑纹，从而出现不同的“艺向”。

Rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)在植物的叶片当中含量丰富，对于调节植物色素、光合作用碳同化和光呼吸都有着重要作用，而在叶斑艺兰花中，叶片出现的黄色或白色等长短不一、粗细各异的条状艺色斑纹，该基因呈现下调表达形式，而现有研究表明Rubisco活性的表达有赖于RCA的调节作用，在RCA的作用下Rubisco才能表现出羧化或是加氧的活性，针对叶斑艺兰花中调节Rubisco基因表达的RCA(Rubisco activase)基因的探究以及应用成为研究方向，且目前还未见相关报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一个可显著影响铁皮石斛生长的基因片段叶斑艺兰花RCA基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，该基因片段在铁皮石斛中正常表达，且促进铁皮石斛的生长发育以及多糖合成。

本发明的另一个目的是提供一种铁皮石斛植物模型，该模型通过敲除RCA2基因后，铁皮石斛无叶绿体形成，作为为研究中的对比测试，此技术方法为兰科植物的基因编辑和新品种选育提供参考，具体的RCA2基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，是通过与叶斑艺兰花RCA基因序列比对，在铁皮石斛中获得的同源RCA基因。

本发明还提供了上述基因的重组载体及重组载体的构建方法，包括以下步骤，

(1)叶斑艺兰花RCA基因的扩增；

对转录组中获得的RCA基因序列进行比对，发现RCA基因序列具有5’，利用RACE技术对3’进行扩增，得到全长基因片段；根据叶斑艺兰花RCA基因在NCBI中的比对结果获得铁皮石斛中的RCA的同源基因RCA2；

(2)过表达载体pCAMBIA1300-35S-RCA和敲除载体pCAMBIA1300DM-OsU6-Cas9的构建；

根据叶斑艺兰花RCA基因进行引物设计，使用高保真酶克隆基因，并用其双酶切pCAMBIA1300-35S载体，所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，将所得到的载体片段进行回收，与RCA的PCR产物进行体外同源重组反应，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行鉴定，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达的重组载体pCAMBIA1300-35S-RCA，之后获得重组质粒；