[发明专利]优化的高产率表达多肽的表达盒

说明书

提供了优化的高产率表达多肽的表达盒。具体提供了一种稳定转染有至少一种表达盒和/或至少一种表达载体的CHO宿主细胞，其中所述至少一种表达盒和/或至少一种表达载体整合入所述宿主细胞的基因组，所述表达盒用于表达目标多肽，所述表达盒包括包含SEQ ID NO:1、2或7的5’UTR多核苷酸序列与hCD33分泌性前导序列。本发明尤其提供以高产率生成目标多肽的新型表达盒、表达载体和方法。

技术领域

本发明尤其涉及适于表达目标多肽的表达盒，其中所述表达盒包括特定的5’UTR和hCD33分泌性前导序列的组合。发现此遗传元件的特定组合意外地引起目标多肽表达水平显著优于其它5’UTR与其它分泌性前导序列的组合。因此，使用此表达盒有利于高产率生成目标多肽。

背景技术

大量克隆和表达目标多肽的能力变得越来越重要。生成和纯化高水平蛋白的能力对于人用药物和生物技术领域，例如合成蛋白药物以及基础研究例如结晶蛋白以能测定其三维结构尤其重要。其他情况下难以获得一定量的蛋白能在宿主细胞中过表达且随后被分离和纯化。

选择生成重组蛋白的表达系统取决于多种因素，包括目标蛋白的细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和生物活性以及产生治疗性蛋白的调节问题和经济考虑。哺乳动物细胞相比其它表达系统如细菌或酵母的关键优势是完成合适蛋白折叠、复杂N-连接糖基化和真O-连接糖基化的能力以及广谱的其它翻译后修饰。由于所述优势，真核且特别是哺乳动物细胞是目前用于生成复合治疗性蛋白如单克隆抗体的表达系统的选择。

获得高表达宿主细胞(也称为高生产子)的最常见方法以产生合适表达载体以表达目标产物作为第一步。所述表达载体驱动编码目标产物的多核苷酸在宿主细胞内表达且通常包括至少一个选择标记以产生重组细胞系。除了编码目标蛋白的多核苷酸，用于在宿主细胞内表达多肽的表达载体通常还包括适于驱动转录的转录控制元件作为表达盒元件，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。此外，一般包括适当翻译控制元件且操作性连接待表达的多核苷酸，如合适的5’UTR和3’UTR。

为增加所述表达系统的效率，优化不同元件，尤其是有助于转录和翻译效率、蛋白合成、ER内正确折叠和蛋白分泌的DNA序列。没有经优化翻译和分泌组件的高产率表达系统可能导致mRNA不稳定、蛋白质分泌不足、错折叠(失活)蛋白积聚于细胞质或膜中。因此，对能稳定和持续翻译并分泌正确折叠蛋白进入细胞培养基的表达系统尤其感兴趣。这种分泌系统提供以下优势：稳定和有效的mRNA翻译；正确的蛋白折叠和有效分泌，简单且快速的产物纯化过程，以及相较胞质系统产率提高。然而，多数可用分泌系统的产物产率尚未充分优化。为提高生产率和分泌效率，一个目标是优化分泌信号(本文也称为信号肽或分泌性前导序列)以及其与不同5’UTR序列的组合，从而获得产生所需高水平表达的遗传元件组合。

来自原核或真核生物的大部分分泌和膜结合蛋白具有氨基末端前导肽(也称为分泌性前导序列或信号肽)，其在生物合成期间从新生前体多肽中切割。分泌性前导序列通常长度为5-60个氨基酸。此序列对于分泌而言是必须且充足的。分析大量这类分泌性前导序列显示在没有显著氨基酸序列同源性的情况下出现的共同结构基序[Von Heijne,1981；Perlman等,1983]。一般，分泌性前导序列由带正电荷的氨基末端(n)、疏水核(h)和极性更高的定义信号肽酶切割位点的羧基末端(c)组成。分泌性前导序列的“n”区长度为约5-8个氨基酸且特征为存在碱性残基。“h”区包含8-12个非极性氨基酸，其平均构成为37％亮氨酸、15％丙氨酸、10％缬氨酸、10％苯丙氨酸、7％异亮氨酸和21％疏水氨基酸如甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或色氨酸。此区域形成α-螺旋的倾向高，所述构象可促进与脂双层内部的相互作用。对分泌性前导肽结构特征的研究主要基于细菌蛋白，表明“h”区对信号序列功能关键[Gierasch,1990]。通过缺失或者疏水残基被亲水或带电氨基酸取代来破坏h区可导致信号功能损失，而改变“n”区的影响不大[Bird等,1990]。羧基末端或切割区通常长度为约6个氨基酸。该区域参与信号肽酶识别和切割，一般需要其来实现蛋白的最终折叠和分泌。