[发明专利]一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞及其制备方法

说明书

本发明公开了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR‑T细胞及其制备方法。属于医药生物领域，其中，所述CAR‑T细胞同时表达MSLN‑CAR和PD1抗体；步骤：构建重组慢病毒质粒；制备重组慢病毒；分离、活化T细胞；将重组慢病毒感染T细胞；CAR‑T细胞体外培养；CAR‑T细胞扩增；收集CAR‑T细胞。本发明分泌的PD1抗体，能够特异性的与T细胞表面的PD1相结合，阻断肿瘤微环境中PD1/PDL1通路对T细胞的抑制作用，进而增强CART对肿瘤细胞的杀伤效果。本发明还涉及自分泌PD1抗体的靶向人Mesothelin的CAR‑T细胞在抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。

技术领域

本发明属于医药生物领域，涉及一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的 CAR-T细胞及其制备方法。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力；CAR由CD8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。T细胞经修饰后，表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞，使T细胞表面表达相应的CAR，再将此修饰的T细胞再输回患者体内，修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。

虽然CAR-T细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用，但二代、三代CAR-T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战，主要包括：缺乏肿瘤特异性抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效的到达肿瘤部位，CAR-T细胞浸润实体瘤的能力不足、存活时间短，以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CAR-T细胞的抗肿瘤疗效，如T细胞膜蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞激活因子3(LAG-3)、细胞毒性T 淋巴细胞-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其两个主要配体PD-L1、PD-L2等。

肿瘤抑制性免疫微环境是CAR-T在实体瘤中疗效不佳的重要原因。程序性死亡受体1(PD-1)是T细胞活化的负调节，通过与其两个配体PD-L1、PD-L2 相互作用来限制T细胞的活性。抑制免疫负调控取得了突破性进展，例如抗 CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1等免疫检查点单抗阻断质量，开创了癌症治疗新时代。目前应用于临床研究的PD-1或者PD-L1抗体，通过阻断PD-1或者PD-L1 通路，部分恢复T细胞的功能，使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗多种类型肿瘤的潜力。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌等都均显示良好的临床疗效。且PD-1和PD-L1 的单抗已被美国食品药品监督局(FDA)批准用于复发或难治性恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。

MESOTHELIN是一种肿瘤相关抗原，在大多数的恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及某些肺癌中有表达，并且正常组织中表达范围窄、表达量低。因而可以作为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌的免疫治疗靶点.

本技术方案采用的是第四代的CAR结构，CAR-T细胞在识别Mesothelin的同时能够分泌PD-1抗体，分泌的PD-1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PD-L1分子与CAR-T细胞的结合，从而解除PD-L1对CAR-T细胞的抑制作用，本技术方案因此能够提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的 CAR-T细胞及其制备方法。

技术方案：在本发明的第一方面，本发明提供了一种分泌PD1抗体的靶向mesothelin的CAR-T细胞，

包括如下细胞：