[发明专利]L-丝氨酸生产菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种L‑丝氨酸生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；(2)将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE‑N上，获得第一重组表达载体；将pGEX‑kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX‑kan上，获得第二重组表达载体；(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L‑丝氨酸生产菌。本发明通过上述技术手段的结合，成功构建得到高产的L‑丝氨酸生产菌，L‑丝氨酸的产量可达110g/L。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种L-丝氨酸生产菌及其构建方法。

背景技术

L-丝氨酸(L-Ser)可以促进脂肪以及脂肪酸的合成，同时还是半胱氨酸和色氨酸等物质的合成前体，具有重要的生理功能，被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。目前L-Ser的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和微生物发酵法；其中微生物发酵法原料来源广泛，能耗低，对环境友好，是L-Ser生产研究的重点。

生物体中L-Ser合成途径受到严谨的调控，且生成的L-Ser很容易被降解，这些因素限制了L-Ser的过量合成。因此，微生物发酵生产L-Ser仍比较困难。

大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，其生物化学性质、生理学性质及遗传背景等各方面均被广泛深入研究。但目前利用大肠杆菌生产L-丝氨酸的研究不多，祁庆生等以葡萄糖为发酵底物，改造大肠杆菌，敲除编码L-丝氨酸脱氨酶的基因sdaA来弱化L-丝氨酸向丙酮酸的分解代谢，过表达L-丝氨酸的合成路径的基因serA^FR、serB、serC，使更多的代谢流流向目的产物的合成，敲除抑制蛋白IclR、ArcA和aceB使菌体的代谢分布发生变化，在揺瓶中使L-丝氨酸的产量达到4.5g/L，发酵罐中扩大培养使L-丝氨酸的产量达到8.34g/L。李旋等对野生型大肠杆菌MG1655进行了系统的代谢工程改造，从头构建了1株L-Ser生产菌，其主要是在基因组水平上阻断了L-Ser向丙酮酸降解，增强了L-Ser合成酶类的表达，并对L-Ser转运系统进行了改造；为进一步促进L-Ser的积累，还对SHMT的表达进行了调控，最终构建的工程菌种在5L罐上发酵28h，可生产22.31g/L的L-Ser。

上述构建大肠杆菌基因工程菌虽然在一定程度上解决了L-Ser难以过量合成的问题，但L-Ser的表达量仍有待进一步的提高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种L-丝氨酸生产菌及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种L-丝氨酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；

(2)将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE-N上，获得第一重组表达载体(pQE-serBC)；

将pGEX-kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX-kan上，获得第二重组表达载体(pGEX-serA)；

(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L-丝氨酸生产菌。