[发明专利]一种检测金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒和方法

说明书

本发明提供了一种基于环介导等温扩增技术的检测金黄色葡萄球菌的方法，并提供了检测引物和试剂盒。本发明方法采用能够扩增靶基因DUF1361domain‑containing protein(GenBank登陆号为CP038229.1)的引物进行扩增，利用羟基萘酚蓝显色实现快速的可视化检测，特异性高、灵敏度高，检测结果准确可靠，具有非常好的推广应用价值。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种检测金黄色葡萄球菌的引物、试剂盒和方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的人类病原体，其可分泌多种毒力因子(肠毒素、溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶等)，具有很强的致病性。金黄色葡萄球菌可以引起广泛的临床感染，从局部的皮肤和软组织感染到危及生命的坏死性肺炎，脓毒血症等。同时，它也是骨关节、胸肺、和医院设备相关感染的主要原因。因此，开发一种可靠、快速、准确的诊断方法用于金黄色葡萄球菌的检测，是临床上的迫切需求。

传统的金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括：细菌培养法、免疫学方法、分子诊断方法。细菌培养法是临床微生物检测的常规方法。具有操作简便，所需设备简单，成本相对较低的优点。但其检测周期过长，通常需要2-5天才能得出诊断结果。为此，许多病人可能会错过最佳治疗期。此外，诊断结果出来前的临床经验性用药可能导致细菌产生耐药性。免疫学方法易受抗体纯度或质量影响，存在较为严重的交叉反应，假阳性多。分子诊断方法具有很高的灵敏度和特异性，并且可在短时间内完成检测。PCR方法，可以快速、灵敏地检测金黄色葡萄球菌，但PCR检测需要昂贵的实验仪器、试剂和熟练的操作人员，这不利于在基层医疗单位推广。

随着分子生物学的发展和人们不断对传统核酸扩增技术的改进，2000年Notomi等人报道了一种快速、便捷的核酸扩增方法：环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)。LAMP技术利用四条引物来识别目标序列，具有高选择性和良好的扩增特异性。它可以在等温条件下(65℃左右)，一小时内将微量的初始DNA拷贝扩增到一百万个拷贝，而且不需要模板的预变性。反应结果可通过浊度、电泳、荧光及比色等方法进行检测。LAMP技术相比于传统技术具有反应时间短、操作简单等优势，但其引物设计复杂，快速检测过程中稳定性和准确率与常规PCR相比尚有一定差距。

目前已有研究人员建立了基于LAMP技术的检测金黄色葡萄球菌的方法，例如张小雨等人以金黄色葡萄球菌的nuc基因(GenBank NO.DQ507379.1)为靶基因，设计引物构建了金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，特异性良好，最低检测线27copies/μL，达到PCR方法的100倍(张小雨,王雯雯,马臣杰,吴晓玲,邓光存.金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及应用[J].农业生物技术学报,2021,29(09):1845-1854.)；Koide等人基于mecA和spa基因作为靶基因构建了金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，特异性高达100％，灵敏度分别为69.2％、52.9％(Koide Y,Maeda H,Yamabe K,et al.Rapid detection of mecA and spa by theloop-mediated isothermal amplification(LAMP)method.[J].Letters in AppliedMicrobiology,2010,50(4):386-392.)。可见，上述报道的现有技术所构建的LAMP方法的检测灵敏度、准确性等方面均还有待进一步提升。

因此，还需进一步探索建立更加简便、快速、准确地检测金黄色葡萄球菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LAMP技术的简便、快速、准确地检测金黄色葡萄球菌的方法。