[发明专利]一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用

说明书

本发明提供一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用，该筛选方法，包括：(1)由橡胶树白粉菌基因中选取潜在效应蛋白的编码基因A；(2)构建橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体，在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A，得炭疽菌转化子；(3)将效应蛋白表达程度高的炭疽菌转化子培养，接种至离体的橡胶叶片，测定其致病能力；若相比野生型，胶孢炭疽菌转化子的致病力下降，则表明该效应蛋白编码基因A为无毒基因。本发明的筛选方法，可直接通过不同效应蛋白基因转化子的致病力筛选出白粉菌无毒基因，实现橡胶树白粉菌无毒基因的更加快速地筛选和鉴定，有利于加强橡胶白粉病的防控以及抗病品种选育。

技术领域

本发明涉及微生物基因工程技术领域，特别涉及一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用。

背景技术

白粉菌为植物白粉病的病原真菌，在重要粮食作物和经济作物上可引起严重的产量损失。橡胶树白粉病是橡胶树一种常见的叶部病害，橡胶树白粉菌侵染重要经济作物巴西橡胶树，影响橡胶树生长，引起天然橡胶的产量明显下降。而目前对于橡胶树白粉菌的遗传多样性领域的研究仍旧较少。

无毒基因一般编码为病原物分泌的能触发植物抗性反应的蛋白。现有在麦白粉中，已鉴定了白粉菌为专性活体寄生，并且发掘了多个小麦白粉菌无毒基因，这对指导作物抗病品种的选育具有较大意义。但在橡胶树白粉菌的无毒基因还未被报道，由于橡胶白粉菌本身无法进行基因操作或外源转化，其受技术的限制，现有仍未能对白粉菌建立可靠的遗传操作技术，而且巴西橡胶树遗传操作的难度大，较大地限制了橡胶树抗病品种选育的发展，因此，寻找一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，有利于为建立橡胶白粉病的防控体系以及抗病品种的选育提供重要的技术支持。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法、效应蛋白及应用，能够有效实现了对橡胶树白粉菌无毒基因的筛选和鉴定。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种橡胶树白粉菌无毒基因的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：由橡胶树白粉菌基因中选取潜在效应蛋白的编码基因A；

步骤2：构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体，并通过在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A，得到炭疽菌转化子；

步骤3：根据测定的效应蛋白设计PCR引物，以及利用定量PCR检测效应蛋白在菌株中的表达量，得到效应蛋白表达程度高的炭疽菌转化子，培养，收集分生孢子，并接种至离体的橡胶叶片上，测定炭疽菌转化子的致病能力；

步骤4：以野生型胶孢炭疽菌作为对照；若相比野生型，胶孢炭疽菌转化子的致病力下降，则表明转化的白粉菌效应蛋白触发了橡胶树的抗病性，该效应蛋白编码基因A为无毒基因。

进一步说明，步骤2中，所述构建含有编码基因A的橡胶树白粉菌效应蛋白表达载体的方法为，将白粉菌效应蛋白编码基因cDNA序列克隆至含有T7启动子和遗传霉素G418抗性基因的pFL2真菌表达载体中，将该白粉菌效应蛋白编码基因插入在3×HA标签之前，在胶孢炭疽菌核糖体蛋白的组成型启动子CgRP60之后，得到橡胶树白粉菌效应蛋白的表达载体。

进一步说明，所述CgRP60启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步说明，所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步说明，所述G418抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步说明，所述3×HA标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步说明，所述在胶孢炭疽菌中表达转化该白粉菌的潜在效应蛋白基因A的方法为采用PEG介导的原生质体转化法。