[发明专利]一种高产瓦伦烯基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1-10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；

S2、构建瓦伦烯生产相关基因表达模块：ERG20-Linker-SmVS模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和瓦伦烯合成酶的编码基因SmVS，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述SmVS的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

S3、构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述瓦伦烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS-A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；

S4、构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；

S5、将步骤S5所述角鲨烯合酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产瓦伦烯基因工程菌；

所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

2.如权利要求1所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1-F和tCYC1-R、tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；

S2、将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。

3.如权利要求1所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20-Linker-SmVS模块的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20-F和ERG20-Linker-W-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；

S2、用引物tERG20-W-F和tERG20-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段tERG20；

S3、以质粒pGZ221为模板，用引物Linker-SmVS-F和SmVS-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段Linker_SmVS；

S4、将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA片段tERG20和步骤S3获得的DNA片段Linker_SmVS，通过用引物ERG20-F和tERG20-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达ERG20-Linker-SmVS模块，即ERG20_Linker_SmVS_tERG20。

4.如权利要求3所述的一种高产瓦伦烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。