[发明专利]一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用，所述方法包括：将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；收集沉淀，进行冻存；复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。所述造血干细胞分离纯化的方法操作简单，生产效率高而成本较低；制备得到的造血干细胞活性好，纯度高，增殖能力强，具有实际应用的价值。

技术领域

本发明属于干细胞制备技术领域，尤其涉及一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用。

背景技术

脐血也叫脐带血，是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近十几年的研究发现，脐血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。

脐血已成为造血干细胞的重要来源。世界范围内，脐血目前已经用于治疗各种类型的白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、粘多糖病、地中海贫血、骨髓发育不良症候群、原发性免疫缺陷病、慢性肉芽肿等80多种疾病。

脐带血造血干细胞具有以下优点：采集方法简单，来源充足；对母亲和新生儿无任何不良影响；比骨髓和外周血来源的造血干细胞更原始，细胞增殖速度更快；被病毒如巨细胞病毒、艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等感染的风险较低；移植后引起抗宿主病(GVHD)的风险较低；脐血移植相对于骨髓移植而言，对HLA配型要求相对更低，缩短了供体寻找的时间；移植费用降低，移植成功率更高。

目前，国内外已有一些关于脐带血中有核细胞的分离方法，常见的有：密度梯度离心法、甲基纤维素法、3％明胶法、6％羟乙基淀粉法、NH₄Cl溶解法以及试剂盒提取法等。国内外学者的研究发现，3％明胶沉降法和6％羟乙基淀粉沉降法的分离效果比较好，CD34+细胞(造血干细胞表面标志分子)和有核细胞回收率高；其次是试剂盒提取法和NH₄Cl溶解法。

刘斌等人(刘斌等，三种不同方法分离脐血造血细胞的比较，中华血液学杂志，1999，20(5)，271.)的研究发现，使用羟乙基淀粉和明胶沉降分离后，CD34+细胞和CFCs(集落形成细胞)的损失率均很小，满足了建立脐血库的要求。脐血库主要保存的是脐血单个核细胞，目前从脐血中分离纯化CD34+造血干细胞主要的方法是通过免疫磁珠法(MiniMACS)进行分离纯化，得到高纯度的CD34+造血干细胞。但这种方法分离纯化CD34+造血干细胞的成本高，很难大规模应用。

因此，如何提供一种操作简单、生产成本低、纯度较高的造血干细胞的分离纯化的方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用，本发明先使用分离液进行单个核细胞的分离，再通过冻存及复苏，进一步去除粒细胞和红细胞等成熟细胞，制备得到的造血干细胞纯度更高，操作简单，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种造血干细胞分离纯化的方法，所述方法包括：

将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；

吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；

收集沉淀，进行冻存；

复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。