[发明专利]卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，其中卤醇脱卤酶通过序列的突变形成卤醇脱卤酶突变体、对编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌在催化合成(S)‑1‑氯‑3‑苯氧基‑2‑丙醇时的立体选择性较高，相较卤醇脱卤原始酶的催化合成拆分的纯度和收率更高，有利于工业生产。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、重组质粒、基因工程菌及其应用。

背景技术

手性1-氯-3-苯氧基-2-丙醇是一种重要的有机合成中间体，可用于合成大量生物活性分子，广泛应用于医药化学品、农用化学品等行业。手性邻卤醇的合成受到研究者们的广泛关注，现有技术报道了不对称硼氢化法、(转移)氢化法、R-氯酮的生物催化还原和卤代从的动态动力学拆分等方法。但是传统的化学合成方法使用金属催化剂，毒性大，对环境污染严重，并且反应条件苛刻，往往需要较高的反应温度和较长的反应时间，反应收率低，同时反应的立体选择性不高。与化学法相比，生物法催化法具有底物谱广、对映选择性高、反应条件温和、环境友好等特点使其在制备手性化合物中具有无可比拟的优势。

立体选择性卤醇脱卤酶是一种重要的手性合成工具酶，在制备手性邻卤醇方面具有广阔的应用前景，日益受到重视。目前虽然已报道卤醇脱卤酶大约80余种，主要分为7大类型。但是目前已知的绝大部分卤醇脱卤酶立体选择性不尽人意，严重制约了其在手性中间体合成中的开发应用。高健课题组从Pseudomonas umsongensis中克隆、异源表达卤醇脱卤酶得到了新的卤醇脱卤酶基因，催化10mM 1-氯-3-苯氧基-2-丙醇合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，收率只有16.97％(化工进展,2019,38(8):3823-3828)。另外，该课题组从一株细菌中的克隆的卤醇脱卤酶AbHHDH,催化20mM 1-氯-3-苯氧基-2-丙醇合成(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，收率只有30.7％(Catalysis Letters,2019,149:629–637)。

因此，通过分子生物学的方法对卤醇脱卤酶进行改造，以提高其在手性化合物的合成收率，尤其是催化合成手性1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的收率具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，具体地说是，卤醇脱卤酶通过序列的突变形成卤醇脱卤酶突变体、对编码卤醇脱卤酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌在催化合成拆分(S)1-氯-3-苯氧基-2-丙醇时的立体选择性较高，相较卤醇脱卤原始酶的催化合成的纯度和收率更高，有利于工业生产

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种卤醇脱卤酶突变体，卤醇脱卤酶突变体在SEQ ID NO.1所示序列中R位进行组合突变，所述R位为R1到R21，且在其N端添加6个组氨酸。

进一步地，所述R1位为第3位赖氨酸，R2位为第6位天冬酰胺、R3位为第9位异亮氨酸、R4位为第16位的缬氨酸、R5位为第21位的丙氨酸、R6位为第22位的丝氨酸、R7位为第23位的缬氨酸、R8位为第25位的异亮氨酸、R9位为第27位的谷氨酸、R10位为第37位的丝氨酸、R11位为第39位的缬氨酸、R12位为第41位的谷氨酸、R13位为第42位的天冬酰胺、R14位为第45位的亮氨酸、R15位为第48位的丝氨酸、R16位为第51位的缬氨酸、R17位为第56位的脯氨酸、R18位为第61位的天冬氨酸、R19位为第63位的谷氨酸、R20位为第66位的亮氨酸、R21位为第179位天冬酰胺。