[发明专利]一种IRES突变体及其应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种IRES突变体及其应用。所述IRES突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。本发明通过构建IRES元件随机点突变文库,并经过筛选，最终筛选到IRES突变体，该IRES突变体能高效地驱动其前后两个相对独立的基因表达且序列更短。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种IRES突变体及其应用。

背景技术

为研究单个基因的功能机制或者需实现多个基因协同表达，需要同时表达多个目标基因。目前常用的多顺反子表达方法，是利用内部核糖体进入位点（Internal RibosomeEntry Site，IRES）或者自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide，2A)等元件来连接多个基因，来实现在单个载体上表达多个基因的目的。

IRES是天然存在于一系列mRNA中的翻译增强子，存在于两个目的基因之间时介导翻译内部的起始。IRES元件具备不依赖帽子结构而独立募集核糖体的功能，进而可以启动下游基因的翻译。当处在IRES元件前后的两个基因相对独立时，就可以表达得到完整的目的蛋白。

虽然，IRES元件可以驱动前后的两个基因表达完整的目的蛋白，但是，IRES元件对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱，导致其后基因的蛋白不表达或者表达量较低。另一方面IRES的序列较长，其应用时常受到载体容量的限制。

发明内容

IRES作为翻译调控元件，在病毒载体中，具有介导其前后两个基因“同时转录，独立翻译”的能力。本发明的目的在于发现一种新的IRES元件，相对于野生型的IRES元件，其序列更短，且位于IRES元件后基因翻译起始能力增强。

申请人基于较短的IRES元件（来源于HCV）设计并构建了一个IRES元件随机点突变慢病毒文库，通过文库多轮筛选获得可以同时高效驱动前后基因表达的新的IRES元件。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种IRES突变体，所述IRES突变体的核苷酸序列如SEQID NO：4或SEQ ID NO：5所示。

应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列（及本发明中的其他序列）具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的序列也在本发明的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本发明的保护范围之内。

本发明第二个方面公开了一种筛选IRES突变体的方法，其包括：

S1：构建IRES元件随机点突变文库；

S2：将带有突变的序列克隆至慢病毒载体当中，然后对文库进行慢病毒包装并在细胞内通过荧光标记基因进行筛选，富集荧光强度前4%-6%的细胞即为目的细胞；

S3：对目的细胞再进行测序，得到相应的IRES突变体序列。

应当理解，本发明中在S1之前、S2和S3之间、S3之后还可以包括其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，在S1中，基于野生型IRES模板，采用随机突变试剂盒使得目标片段发生随机突变；

更优选的，所述野生型IRES模板的序列如SEQ ID NO：1所示；

更优选的，还包括设计引物序列，IRES的正向引物和反向引物序列，分别如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示。