[发明专利]一种产雄甾-1,4二烯-3,17-二酮的分枝杆菌及其应用

说明书

本发明具体涉及一种产雄甾‑1,4二烯‑3,17‑二酮(ADD)的分枝杆菌Mycobacterium sp.CICC 21097(R)，该菌已于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC M 2021383。Mycobacterium sp.CICC 21097(R)是生物合成ADD的常用菌株Mycobacterium sp.CICC 21097的突变株。本发明还公开了Mycobacterium sp.CICC 21097(R)发酵生产雄甾‑1,4二烯‑3,17‑二酮的方法，包括种子、发酵培养基成分和培养条件。突变株的雄甾‑1,4二烯‑3,17‑二酮产量较亲本菌株Mycobacterium sp.CICC 21097提高29.82％～43.72％，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株用于生产雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的分枝杆菌及其应用。

背景技术

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是一种重要的类固醇医药中间体，在类固醇工业中占有重要的地位。以ADD为起始原料，可以合成多种甾体类药物，目前，工业上已实现ADD向炔诺酮、哒那错、新药诺美孕酮、睾酮、福美司坦等甾体药物的产业化合成。近年来，随着甾体药物的进一步开发和使用，甾体药物中间体ADD的市场需求量日益增加。传统生产ADD的方法，是以薯蓣皂素为原料，通过化学的方法加工合成，但原料薯蓣皂素短缺和加工过程污染环境等问题，限制了甾体激素类药物的发展。因此，有研究者提出了以植物甾醇为原料，通过微生物转化获得ADD的工艺。该工艺可节约生产成本，同时减少了对环境的污染。

本发明所涉及的菌株Mycobacterium sp.CICC 21097(R)是生物合成ADD的常用菌株Mycobacterium sp.CICC 21097的突变株。Mycobacterium sp.CICC 21097(R)已于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021383。与亲本菌株相比，Mycobacterium sp.CICC 21097(R)转化植物甾醇生产ADD的能力显著提高，具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株分枝杆菌Mycobacterium sp.CICC 21097(R)，以及其转化植物甾醇生产雄甾-1,4二烯-3,17-二酮(ADD)的方法。

该菌株已于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2021383，该菌株是从Mycobacterium sp.CICC 21097的培养过程中分离出来的突变菌株。Mycobacterium sp.CICC 21097是生物合成ADD的常用菌株。与Mycobacterium sp.CICC21097相比，突变株Mycobacterium sp.CICC 21097(R)转化植物甾醇生产ADD的能力显著增强，且菌落表面更为干燥和粗糙、菌体自凝集特性和菌膜形成能力明显增强。利用突变菌株Mycobacterium sp.CICC21097(R)转化植物甾醇生产ADD的技术方式，具体如下：

首先，将-80℃液体冷冻保存的突变株在LB液体培养基中活化培养，LB液体培养基包括：酵母浸粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，LB液体培养条件包括：温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为2d。随后，接种于种子培养基，种子培养基包括：果糖25g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 10g/L。种子培养条件包括：pH为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为36h。最后，将制备好的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基包括：果糖15～25g/L，磷酸氢二铵7.2～12g/L，黄豆饼粉4.8～8g/L，NaCl 10g/L，K₂HPO₄3g/L，MgSO₄ 0.2g/L，MnCl₂ 5×10^-4g/L，Tween 80 2.8～5g/L，植物甾醇5g/L。发酵培养条件包括：pH为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为4d。