[发明专利]一种切向流超滤纯化15价肺炎球菌多糖蛋白结合物的工艺方法

说明书

本发明提供了一种切向流超滤纯化15价肺炎球菌多糖蛋白结合物的工艺方法，所述步骤采用不同膜包孔径、超滤倍数、维持体积、跨膜压差、清洗次数等切向流超滤工艺参数去除1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F型共15种肺炎球菌多糖蛋白结合物中间样品中的小分子化合物，缩短超滤时间，减少原料损耗，提高回收率，超滤结束后的膜包采用碱溶液处理，水通量能快速的恢复到初始值，简单快捷效率高。该方法纯化过程中所用液体只需0.85％氯化钠溶液，在疫苗生产过程中，0.85％氯化钠溶液是常用溶剂，产品质量安全性好，且能降低浓缩透析等操作过程中膜的穿透渗漏等风险，能防止生产过程中产品因泄露导致的环境污染和人员危险事件的发生，适用于多种疫苗制备领域，生产成本低、效率高，有良好的经济价值。

技术领域

本发明属于生物疫苗纯化方法，具体涉及一种15价肺炎球菌多糖蛋白结合物纯化工艺。

背景技术

肺炎球菌是导致肺炎、中耳炎、脑膜炎等病的主要病因，发病人群以老人儿童为主，预防肺炎球菌感染的疫苗主要包括肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗这两类疫苗。

肺炎球菌多糖疫苗主要对老年人及一些免疫力较弱的人群有保护作用，对2 岁以下婴幼儿的保护效果弱，且受时间年限影响。肺炎球菌多糖与蛋白质结合形成的疫苗可以将肺炎球菌多糖从非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，肺炎球菌多糖与蛋白结合制备的疫苗能诱导婴幼儿产生良好的免疫记忆。

切向流过滤也叫超滤，是一种膜分离技术，以压力差为推动力，在分离过程中主要依靠流速和压力，通过膜孔径的大小来筛选分离不同分子水平的物质，小分子成分透过膜孔径滤出，大分子成分被截留。超滤过程不需要加热，可在常温下进行，条件温和、能耗低，不发生相变化，无需另加其他化学试剂，无污染，分离效率高，即可浓缩又可透析置换溶剂，有利于低浓度溶液中微量成分的收集，且拆装简单、操作方便、便于清洗和维护，因而广泛应用于医药、食品、环保等领域。

目前我国市面上销售的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗主要是进口疫苗，以英国葛兰素史克公司的“10价肺炎球菌结合疫苗”和美国辉瑞公司的“13价肺炎球菌结合疫苗”为主，多糖蛋白结合物是结合疫苗的主要抗原成分，其制备方法包括 CDAP介导的氰基活化法和胺还原法等，本发明内容是以胺还原法来制备肺炎球菌多糖蛋白结合物，该方法是多糖溶液经醋酸水解、高碘酸钠氧化得多糖氧化物，氧化多糖与己二酰肼(ADH)在硼氢化钠作用下衍生，在碳二亚胺(EDAC)作用下与载体蛋白结合形成结合物，切向流超滤的主要目的就是选取不同孔径的超滤膜包与超滤倍数，使过程中的己二酰肼(ADH)、硼氢化钠、碳二亚胺(EDAC) 等小分子化合物通过膜孔径流出，大分子肺炎球菌多糖蛋白结合物中间产物被超滤膜包截留下来并浓缩收集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效快速纯化15价肺炎球菌多糖蛋白结合物的方法。

本发明所述的纯化方法，包括以下步骤：

(1)用纯化水冲洗切向流超滤系统；

(2)取肺炎球菌多糖蛋白结合物中间产品，用0.85％氯化钠溶液先稀释后浓缩维持一定的体积，使用切向流超滤膜包进行超滤；

(3)浓缩样品并收集，用0.85％氯化钠溶液加压循环清洗系统并收集清洗液。

(4)用0.3mol/L氢氧化钠加压循环冲洗系统，纯化水冲洗并测水通量合格后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存。

其中，优选的步骤1)：

先将膜包中的保存液排空，用纯化水冲洗切向流超滤系统，进料泵速为150～400rpm,调节回流阀使进出口压为0.05～0.15MPa,冲洗10～30分钟，直至透过液与回流液pH值为中性即可。

其中，优选的步骤2)：