[发明专利]一种植物组织培养时外植体灭菌方法

说明书

本发明公开了一种植物组织培养时外植体灭菌方法。属于植物组织培养技术领域。包括如下步骤：将外植体使用水冲洗→使用质量浓度75％的酒精灭菌→无菌水清洗→使用质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液浸泡30～50min或使用质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液浸泡20～30min→无菌水清洗。与现有技术相比，本发明通过方法的改进避免了外植体表面残留酒精对细胞的脱水作用，使次氯酸钠或者升汞灭菌时间延长，表面灭菌更彻底，且不会使外植体灭菌致死。提高了灭菌效率的同时保证了材料的存活，同时次氯酸钠溶液或者升汞溶液可多次循环使用，大大减少了废液处理的次数，降低了对环境污染的可能性。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体的说是涉及一种植物组织培养时外植体灭菌方法。

背景技术

在进行植物组织培养时，外植体的灭菌是必不可少的。一般的灭菌方法包括如下步骤：外植体的清洗→质量浓度为70～75％的酒精灭菌10s左右→质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液中浸泡15～30min或质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液中浸泡5～10min，对表面不光滑和有毛的外植体添加吐温80在次氯酸钠或升汞溶液中→无菌水清洗3～5次。

然而上述方法存在如下缺陷：(1)使用次氯酸钠溶液或升汞溶液灭菌时间不能太长，否则外植体会灭菌致死，然而短时间灭菌可能存在灭菌不彻底的风险；(2)次氯酸钠溶液或者升汞溶液被当做废液需要统一回收和处理，特别是升汞有很强的毒性，不进行固化处理会严重污染环境。

综上，如何提供一种灭菌时间长、灭菌溶剂可重复利用的植物组织培养时外植体灭菌方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种植物组织培养时外植体灭菌方法。该方法可以使灭菌时间延长，外植体表面灭菌更彻底，同时实现次氯酸钠溶液和升汞溶液的循环使用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植物组织培养时外植体灭菌方法，包括如下步骤：

(1)将外植体用水冲洗；

(2)使用质量浓度75％的酒精灭菌；

(3)无菌水清洗；

(4)使用质量浓度5～10％的次氯酸钠溶液浸泡30～50min或使用质量浓度0.1～0.2％的升汞溶液浸泡20～30min；

(5)无菌水清洗。

所取得的有益效果：在现有技术常用的灭菌方案中，由于外植体表面残留有酒精，植物细胞在酒精和次氯酸钠溶液或升汞溶液的共同作用下极易脱水和中毒而死，所以灭菌时间一般控制在10min左右，导致灭菌不彻底，灭菌效率低。另外由于次氯酸钠溶液或升汞溶液中有了酒精就不能重复使用，需要当做废液进行处理，特别是升汞对环境有很大的污染，需要用Na₂S进行固化处理。本发明技术方案与现有技术常用的灭菌方案相比，仅在酒精灭菌后增加了无菌水清洗，但却实现了次氯酸钠和升汞的重复使用，并大大提高了灭菌效率，对于表面光滑的植物外植体可以做到100％彻底表面灭菌。

进一步的，所述步骤(2)中灭菌时间为10～30s。

进一步的，所述步骤(3)和步骤(5)需清洗2～3遍。

进一步的，还包括在步骤(2)之后使用吐温80溶液进行浸泡。

所取得的有益效果：对于表面有绒毛的外植体材料可以在酒精溶液灭菌后在无菌水中添加吐温80进行浸泡和水洗，然后再进行次氯酸钠溶液或升汞溶液的灭菌。

进一步的，所述外植体为红掌、魔芋、滇黄精、竹叶兰或狗脊的外植体。

进一步的，所述步骤(2)～(5)均在超净工作台中进行。