[发明专利]一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其制备方法。质粒载体构建过程中，先设计一段含有NheⅠ‑AgeⅠ‑SbfⅠ‑EcorⅠ‑NsiⅠ‑MluⅠ‑AvrⅡ‑BamhⅠ酶切位点的DNA，对NheⅠ和BamhⅠ双酶切后回收片段，通过相同的酶切位点将回收片段克隆到双酶切后的pCW‑Cas9‑Blast载体得到新克隆载体pCW‑DNA‑Blast。扩增得到带上述酶切位点的PLAUR和GPLD1基因片段并与pCW‑DNA‑Blast经相同的酶切处理后连接即得。本发明首次通过质粒载体使PLAUR基因与GPLD1基因同时表达，从而在细胞培养上清中获得大量PLUAR蛋白。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时表达PLAUR和GPLD1基因的质粒载体及其构建方法。

背景技术

心肌梗塞(AMI)是指急性、持续性缺血、缺氧所引起的心肌缺血性坏死，绝大多数患者可见冠状动脉粥样硬化病变，心肌病变。心肌梗塞的发生是基因和环境因素共同作用的结果。基因和环境因素影响动脉粥样硬化的发生发展，冠状动脉斑块的形态、代谢，斑块不稳定，凝血和纤溶系统的平衡，血栓的形成。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activatorreceptor，uPAR，亦称PLAUR)是一个分子质量为55-60kD的糖蛋白，包含313个氨基酸残基，通过二硫键组成3个同源折叠区域，从N端开始依次被命名为DI、DⅡ、DⅢ。PLAUR不含跨膜序列，其羧基末端(位于DⅢ区域中)连接一个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚，GPI锚将PLAUR连接于细胞膜的磷脂双分子层表面，其氨基末端(位于DI区域中)则提供尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的结合位点，可与uPA高亲和力结合。在炎症刺激下，PLAUR在多种蛋白作用下从细胞膜上脱落，形成可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)。uPAR和uPA已被证明广泛参与多种病理生理过程，包括：蛋白水解、炎症、动脉粥样硬化形成、血管发生、斑块不稳定以及纤溶；这些过程都与心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的发生发展过程密切相关，但具体机制还有待进一步研究。

糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(glycosylphosphatidylinositol specificphospholipase D1，GPDLD1)是一种大量存在哺乳动物血清中的酶，具有两个功能域，一个N端催化域和一个C端β-螺旋桨域。这种酶的功能之一是水解细胞表面的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚，从而从细胞膜上释放附着的蛋白质。

发明内容

本发明首次通过质粒载体使PLAUR基因与GPLD1基因同时表达，从而在细胞培养上清中获得大量PLAUR蛋白，为今后研究PLAUR基因在心肌梗塞、心力衰竭等心血管疾病的作用机制提供基础。本发明获得的载体中PLAUR基因表达获得蛋白，然后GPLD1基因表达有利于释放PLAUR蛋白，从而提高培养上清中的PLAUR蛋白含量。

本发明的构建过程：

构建新克隆质粒载体：人工合成一段DNA，该DNA的序列中含有8个不同且按一定顺序分布的限制性内切酶的酶切位点(比如A、B、C、D、E、F、G、H)，然后在位于该DNA序列中两端位置的限制性内切酶的酶切位点，如A、H，用对应的内切酶进行双酶切，得到具有上述8个酶切位点的DNA片段。选择仅在编码区具有1个上述DNA片段第一端位置的酶切位点(比如A)和1个第二端位置的酶切位点(比如H)的质粒载体并用对应的限制性内切酶进行双酶切处理，回收剩余的质粒载体片段，再将DNA片段克隆到酶切后的质粒载体片段中；

优选地，8个限制性内切酶的酶切位点优选NheⅠ、AgeⅠ、SbfⅠ、EcorⅠ、NsiⅠ、MluⅠ、AvrⅡ、BamhⅠ，具有效率高的特点。

进一步地，选择的质粒载体上还具有四环素诱导表达系统。