[发明专利]一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用

说明书

一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用，通过将编码T4 PNK与Mth RNA ligase的两基因进行基因工程改造，在两编码基因中引入链接序列（Linker），制备一种T4 PNK与Mth RNA Ligase的融合蛋白。活性测试和鉴定显示，融合蛋白同时具有T4 PNK和Mth RNA Ligase的催化活性，能够创新性的直接将羟基末端底物直接催化为腺苷酰化产物，且仍然能够将磷酸化底物催化为腺苷酰化产物。

技术领域

本发明涉及核酸的腺苷酰化修饰技术领域，具体涉及一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用。

背景技术

核酸的序列末端磷酸化（Phosphorylation）是指磷酸基团共价连接到核酸末端的过程。核酸的腺苷酰化（Adenylation）是指一磷酸腺苷（AMP）分子共价连接到核酸末端的过程。磷酸化核酸是含有5’-磷酸基团的核酸，包含磷酸化DNA和磷酸化RNA两类，是各种核酸连接酶催化核酸环化或者连接反应的底物，在分子生物学中应用广泛。

腺苷酰化核酸是含有5’-腺苷焦磷酸基帽的核酸，具有高能焦磷酸键，是一种活化形式的核酸分子。腺苷酰化核酸是核酸连接酶催化的核酸连接反应的中间产物，在一般的连接反应中，连接反应分三个阶段进行。在第一阶段，核酸连接酶的催化赖氨酸残基与ATP形成腺苷酰化的酶；在第二阶段，腺苷酰化的酶将其腺苷基团转移至核酸的5’磷酸末端，形成腺苷酰化的核酸中间产物；在第三阶段，连接酶的赖氨酸残基催化核酸的5’腺苷酰化末端与3’羟基末端之间脱水缩合形成磷酸二酯键，完成连接反应。因此，磷酸化或者腺苷酰化的核酸均可以作为连接酶的底物，完成连接反应。腺苷酰化的核酸包括腺苷酰化的DNA和腺苷酰化的RNA两种，目前以腺苷酰化DNA（AppDNA）应用较多。

磷酸化修饰和腺苷酰化修饰广泛用于高通量测序接头制备、单链RNA或DNA连接、特定连接酶催化的连接反应等分子生物学技术中。以Illumina测序平台的miRNA建库过程为例，传统的建库方式需要在第一接头连接前将RNA去磷酸化处理，防止在连接反应过程中底物RNA的自身环化和连接副产物产生；随后进行第一接头的连接和以第一接头作为引物结合位点进行cDNA第一链的合成。随后对反应产物重新磷酸化和第二接头的连接。这一过程繁琐且复杂。而使用5’预腺苷酰化的接头时，在特定的连接酶催化下，无需ATP的参与，能够避免连接反应的发生，因此无需对底物进行去磷酸化处理，减少了反应步骤，简化了实验流程，有效提升建库的效率。

在单链DNA连接中，5’-腺苷酰化DNA底物由于含有高能焦磷酸键处于活化状态，比5’磷酸化DNA底物更易于进行连接反应。某些DNA连接酶，如K159S位点突变的T4DNA连接酶，仅能催化5’-腺苷酰化DNA底物与3’-羟基末端连接，且其连接活性较野生型连接酶催化磷酸化底物的活性更高，连接反应更容易进行。