[发明专利]一种特异性识别对羟基苄亚硫酸氢的核酸适配体及其应用

说明书

本发明公开了一种特异性识别对羟基苄亚硫酸氢的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核酸适配体是单链DNA，由76个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，其中SEQ13吉布斯自由能DG=‑16.91；基于氧化石墨烯荧光法对核酸适配体的特异性、亲和力等的评估，结果显示核酸适配体SEQ13解离常数Kd=26.75±6.48，能与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合；该核酸适配体SEQ13具有高特异性、高亲和力的特点，能够应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中。

技术领域

本发明公开了一种能够与硫磺熏蒸后天麻产生的标志物对羟基苄亚硫酸氢特异性识别的核酸适配体及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术从寡核苷酸文库中筛选到的能特异性结合靶标物质的寡核苷酸序列，其长度在10-100nt。核酸适配体自问世以来，因其诸多特性和优点被广泛地应用在食品安全检测、环境监测、临床诊断、医学成像与药物研发等众多领域。

天麻为兰科植物天麻的干燥块茎，是我国传统名贵中药材，天麻具有镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、抗衰老、改善记忆力和增强免疫力作用。由于天麻富含多糖类成分，不易保存及运输，因此，产地加工时常采用硫磺熏蒸使天麻快速干燥达到易于保存运输的目的。天麻硫磺熏蒸的过程由于工艺简单且成本低廉而成为天麻的首选加工方式。硫磺熏蒸加工方法作为传统的中药材养护方法已广泛应用到中药材的初加工和仓储等环节；但大量研究已证实硫磺熏蒸不仅会影响药材质量，残留的二氧化硫还会危害人体健康，尤其是药材进入人体后，对肝和肾脏等重要器官的影响较大。因此有必要对天麻硫磺熏蒸的情况进行监测。

目前，硫熏天麻的主要鉴定目标为SO₂的残留量，但中药材中SO₂残留量会随着保存时间的延长而降低，以SO₂的残留量作为评价指标是不够的，还需要其他方法确证。对羟基苄亚硫酸氢是天麻经硫磺熏蒸后形成的一种丰度高、性质稳定的物质，可以较为科学准确的判断天麻硫熏程度。检测对羟基苄亚硫酸氢的方法主要有高效液相串联质谱法。但是这种检测方法需要特定的仪器设备和一定的操作技能，无法广泛应用。因此发展一种操作简单、成本低廉且稳定性和灵敏性均较高的对羟基苄亚硫酸氢检测方法十分必要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种特异性识别对羟基苄亚硫酸氢（ p-Hydroxybenzyl hydrogen sulfite， p-HS）的核酸适配体SEQ13，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该核酸适配体为单链DNA，由76个核苷酸组成，其预测的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=-16.91。

本发明另一目的是将上述特异性识别对羟基苄亚硫酸氢的核酸适配体SEQ13应用在制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中。

本发明目的通过以下技术方案实现：

1、对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体的筛选、测序

采用指数富集的配体系统进化技术（SELEX），通过链霉亲和素（SA）磁珠固定文库的方法筛选出能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体；每轮均采用SA磁珠固定文库的方法进行筛选，在文库富集以后，先用Q-PCR验证次级文库的亲和力，在初筛鉴定有亲和力的情况下，将筛选得到的第8轮文库进行高通量测序样品建库处理，经高通量测序得到与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体序列，通过软件DNAMNA对序列进行同源性分析，获得进化树分析图，挑选不同家族的序列作为候选序列；

2、利用氧化石墨烯（GO）荧光法对核酸适配体SEQ13进行表征